剂量递增：一种在癌细胞中诱导药物耐药性的方法

摘要

来源：Yamaoka T. 等，采用逐步增加阿法替尼剂量建立并表征三种阿法替尼耐药的肺腺癌PC-9细胞系。J. Vis. Exp.，2019

该视频介绍了通过在先前使用MTT法测定药物IC₅₀值后，逐步增加药物剂量处理细胞，从而诱导癌细胞产生耐药性的方法。示例方案详细描述了建立耐药细胞系的逐步操作流程。

方案

1. 建立三株独立的阿法替尼耐药PC-9细胞系

1. 使用3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴盐（MTT）法测定PC-9细胞初始阿法替尼暴露浓度。
   1. 在含10%胎牛血清、青霉素（100 U/mL）和链霉素（100 µg/mL）的生长培养基中，将PC-9细胞接种于经细胞培养处理的10 cm培养皿中，于37 °C、5% CO₂ 培养箱中培养。
   2. 将PC-9细胞以4 x 10⁴ 个细胞/mL的密度重悬于生长培养基中，每孔加入50 µL至96孔微孔板中，最终细胞浓度为每孔50 µL含2.0 x 10³ 个细胞。于37 °C、5% CO₂ 培养箱中过夜培养。
   3. 向含50 µL生长培养基的各孔中加入50 µL不同浓度的阿法替尼溶液：0、0.002、0.006、0.02、0.06、0.2、0.6、2、6 和 20 µM，最终体积为100 µL，阿法替尼终浓度分别为0、0.001、0.003、0.01、0.03、0.1、0.3、1、3 和 10 µM。
   4. 将96孔板置于37 °C、5% CO₂ 培养箱中孵育96小时。
   5. 每孔加入15 µL染料溶液（见 材料表），于37 °C、5% CO₂ 培养箱中孵育4小时；随后每孔加入100 µL溶解/终止液（见 材料表），于37 °C、5% CO₂ 培养箱中过夜孵育。
   6. 使用酶标仪（见 材料表）在570 nm波长处测定光密度（OD₅₇₀）。每组设置6–12个重复孔，并至少独立重复实验三次。
   7. 使用统计学软件（见 材料表）将数据以半对数图形式绘图，并计算IC₅₀ 值，即药物效应抑制至最大效应50%时的浓度（见 材料表）。
2. 在三个独立的10 cm培养皿中，通过逐步剂量递增法对PC-9细胞持续暴露于不可逆EGFR-TKI阿法替尼
   1. 将PC-9细胞接种于含10 mL生长培养基的p100培养皿中。当PC-9细胞达到亚融合状态时，取1 mL细胞悬液转移至三个新的p100培养皿中，每皿加入9 mL新鲜生长培养基。1:10稀释后的PC-9细胞在3–4天内再次达到亚融合状态，细胞密度约为4–5 x 10⁵ 个细胞/mL。
   2. 次日，向三个p100培养皿中各加入相当于IC₅₀ 值1/10浓度的阿法替尼。
      注意： 阿法替尼以DMSO配制，储备液浓度分别为1 μM、10 µM、100 µM、1 mM和5 mM。根据所需终浓度，向10 mL培养基中加入1–10 µL阿法替尼溶液。
   3. 当含阿法替尼的p100培养皿中的细胞达到亚融合状态时，用1 mL移液器充分吹打混匀，取1 mL细胞悬液加入含9 mL新鲜生长培养基的新p100培养皿中，随后向新培养体系中加入比前一阶段高10–20%的阿法替尼浓度。
   4. 在10–12个月内，通过逐步剂量递增法将培养基中阿法替尼浓度从0.1 nM逐步提高至1 μM，每次递增幅度为10–20%。
      注意： 当阿法替尼浓度接近IC₅₀ 值时，细胞生长显著减慢。若以1:9比例传代，细胞可能无法增殖，因高浓度阿法替尼可导致细胞死亡。因此，在较高阿法替尼浓度下，可采用1:2比例传代。最耐药的细胞可在含阿法替尼的培养基中生长3–14天，期间不更换培养基，直至需要传代时为止。
   5. 将获得的阿法替尼耐药细胞在含1 µM阿法替尼的生长培养基中继续培养2–3个月。在1 µM阿法替尼浓度下，该模型建立耐药性需10–12个月。通过MTT实验验证细胞对阿法替尼的耐药性。三个独立建立的阿法替尼耐药细胞系分别命名为AFR1、AFR2和AFR3。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
FBS	gibco	26140-079
青霉素-链霉素（Pen Strep）	gibco	15140-163
细胞培养处理的10 cm培养皿	Violamo	2-8590-03
阿法替尼（afatinib）	Selleck	S1011
96孔微孔板	Thermo	130188
CellTiter 96	Promega	G4100	非放射性细胞增殖检测试剂盒；染料溶液和溶解/终止溶液
NanoDrop Lite 分光光度计	Thermo	NA	分光光度计
GraphPad Prism v.7 软件	GraphPad, Inc.	NA	一款统计分析软件
DMSO	Wako	043-07216