剂量递增：一种在癌细胞中诱导药物耐药性的方法

摘要

来源：Yamaoka T. 等，采用逐步增加阿法替尼剂量建立并表征三种阿法替尼耐药的肺腺癌PC-9细胞系。J. Vis. Exp.，2019

该视频介绍了通过在先前使用MTT法测定药物IC₅₀值后，逐步增加药物剂量处理细胞，从而诱导癌细胞产生耐药性的方法。示例方案详细描述了建立耐药细胞系的逐步操作流程。

方案

1. 建立三株独立的阿法替尼耐药PC-9细胞系

1. 使用3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴盐（MTT）法测定PC-9细胞初始阿法替尼暴露浓度。
   1. 在含10%胎牛血清、青霉素（100 U/mL）和链霉素（100 µg/mL）的生长培养基中，将PC-9细胞接种于经细胞培养处理的10 cm培养皿中，于37 °C、5% CO₂ 培养箱中培养。
   2. 将PC-9细胞以4 x 10⁴ 个细胞/mL的密度重悬于生长培养基中，每孔加入50 µL至96孔微孔板中，最终细胞浓度为每孔50 µL含2.0 x 10³ 个细胞。于37 °C、5% CO₂ 培养箱中过夜培养。
   3. 向含50 µL生长培养基的各孔中加入50 µL不同浓度的阿法替尼溶液：0、0.002、0.006、0.02、0.06、0.2、0.6、2、6 和 20 µM，最终体积为100 µL，阿法替尼终浓度分别为0、0.001、0.003、0.01、0.03、0.1、0.3、1、3 和 10 µM。
   4. 将96孔板置于37 °C、5% CO₂ 培养箱中孵育96小时。
   5. 每孔加入15 µL染料溶液（见 材料表....

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
FBS	gibco	26140-079
青霉素-链霉素（Pen Strep）	gibco	15140-163
细胞培养处理的10 cm培养皿	Violamo	2-8590-03
阿法替尼（afatinib）	Selleck	S1011
96孔微孔板	Thermo	130188
CellTiter 96	Promega	G4100	非放射性细胞增殖检测试剂盒；染料溶液和溶解/终止溶液
NanoDrop Lite 分光光度计	Thermo	NA	分光光度计
GraphPad Prism v.7 软件	GraphPad, Inc.	NA	一款统计分析软件
DMSO	Wako	043-07216