克隆形成实验：评估抗癌药物对克隆形成型肺癌细胞的抑制效果

摘要

来源：Lee, J. Y.等，利用球状体、克隆形成实验和斑马鱼异种移植模型对抗癌香豆素OT48的生物活性进行临床前评估 J. Vis. Exp.(2018)。

本视频介绍了集落形成实验，该实验有助于确定肺癌细胞无限增殖并形成独立集落的能力。通过分析所形成集落的数量和/或大小的变化，我们可以评估抗癌药物对集落形成细胞的影响。

方案

1. 克隆形成实验

1. 在75 cm²培养瓶中，将A549细胞以20,000个细胞/cm²的浓度接种于15 mL RPMI1640细胞培养基中，培养基中添加10%胎牛血清（FBS）和1%抗生素，在37 °C、5% CO₂的CO₂培养箱中培养。
2. 实验当天，使用血细胞计数板测定细胞浓度。取细胞悬液于1.5 mL微量离心管中，以400 × g离心7分钟收集50,000个细胞，弃上清后用100 µL 1×无菌PBS（磷酸盐缓冲液）重悬细胞，置于1.5 mL离心管中。
3. 使用多通道移液器将1.1 mL半固体甲基纤维素培养基（MCBM）分装至15 mL离心管中，每种实验条件准备一管。
4. 使用P200移液器向1.1 mL MCBM中加入110 µL FBS。
5. 按1,000个细胞/mL的密度接种细胞。使用P2移液器从细胞储备液（50,000个细胞溶于100 µL 1× PBS）中吸取2.4 µL细胞悬液，加入含10% FBS的1.1 mL MCBM中。
6. 加入细胞后，将离心管置于涡旋振荡器上，以最高速度垂直振荡1分钟，充分混匀MCBM与细胞。
7. 加入待测化合物（OT48单独使用或与A1210477联用）。另设一管仅加入溶剂作为溶剂对照（此处为二甲基亚砜（DMSO））。根据化合物浓度及每种条件下的加样体积，溶剂对照组应包含所用最高浓度的溶剂，以评估溶剂可能引起的不良影响。
8. 将各管涡旋振荡1分钟。
9. 每项检测中，使用P1000移液器将1 mL混合液加入12孔细胞培养板的中心孔中。
10. 向空孔中加入1 mL无菌水或1× PBS，以维持培养箱内湿度稳定。
11. 将培养板置于37 °C、5% CO₂培养箱中孵育10天。
12. 孵育10天后，向每孔加入200 µL MTT（3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴盐）储备液（5 mg/mL），使终浓度达到1 mg/mL。
13. 在37 °C、5% CO₂培养箱中继续孵育10分钟。活细胞形成的克隆将呈现紫色。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
A549	ATCC	CCL-185	37 C°
RPMI 1640	Lonza	30096	4 C°
FBS	Biowest	S1520-500	-20 C°
青霉素-链霉素	Lonza	17-602E	-20 C°
细胞培养瓶 T75	SPL	70075	RT
PBS 溶液	Hyclone	SH30256.02	RT
1.5 ml 离心管	Extragene	Tube-170-C	RT
15 ml 离心管	Hyundai Micro	H20015	RT
12 孔板	SPL	30012	RT
MethoCult	StemCell Technologies	4230	-20 C°
噻唑蓝四氮唑溴盐（MTT 粉末）	Sigma	M5622	4 C°
LAS4000	GE Healthcare Technologies		RT