斑马鱼异种移植实验：一种评估治疗药物在斑马鱼体内对肿瘤发生抑制效果的方法

摘要

来源：Lee, J. Y 等，利用球状体、克隆形成实验和斑马鱼异种移植模型对抗癌香豆素OT48的生物活性进行临床前评估。J. Vis. Exp. (2018)

本视频介绍了利用斑马鱼异种移植模型评估体内肿瘤形成并研究治疗药物作用的方法。

方案

所有涉及动物模型的实验程序均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 斑马鱼异种移植实验

注意：该技术方法以示意图形式展示（图1）。

1. 储备试剂的配制
   1. 配制1 L 30倍浓度Danieau溶液：1740 mM NaCl，21 mM KCl，12 mM MgSO₄₄•7H₂O，18 mM Ca(NO₃)₂₃)₂，以及150 mM HEPES。使用pH计将缓冲液的pH值调节至7.6。
   2. 配制1%（50倍）三卡因溶液：将20 mg氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐（tricaine）溶于2 mL蒸馏水中。
   3. 配制1%酚红-PBS溶液：加入2 µ酚红钠盐溶液 L 加至 198 µ1.5 mL 灭菌 PBS 溶液 µL型管
   4. 制备3%甲基纤维素：将3 g甲基纤维素加入100 mL 1× Danieau溶液中。
2. 斑马鱼卵的采集与孵化
   1. 将一条雌性斑马鱼和一条雄性斑马鱼分开放置在装有经紫外线灭菌和过滤的自来水、温度为28.5℃的分隔水箱中 °在黑暗环境中饲养。分离24小时后，将两种性别的鱼混合以启动交配。将受精卵从交配缸转移至含有5 mL新鲜Danieau溶液的培养皿中。
   2. 用5 mL Danieau溶液清洗卵子三次。清洗时，用移液器小心吸取卵子，并转移至5 mL新鲜溶液中。在28.5 ℃下孵育8小时。 °C.
      1. 在Danieau溶液中孵育8小时后，更换为含有0.03% 1-苯基-2-硫脲（PTU）的Danieau溶液，以抑制色素形成。挑出不透明的卵（未受精卵或含有未发育胚胎的卵），防止污染。
3. 胚胎去壳
   1. 受精后24小时（hpf），使用尖头镊子去除斑马鱼胚胎的卵膜。将孵化中的胚胎置于含0.03% PTU的Danieu溶液中，于28.5℃培养 °C直至48 hpf。
4. 化合物处理的细胞制备
   1. 将A549细胞以每平方厘米20,000个细胞的密度接种² 在25 cm² 培养瓶。接种24小时后，加入化合物（此处为OT48，50） µM 和/或 A1210477 在 20 µM）在37℃培养箱中孵育24 h °C 和 5% CO₂.
   2. 为每种化合物设置处理时间，以维持细胞存活率的同时促使细胞走向死亡。该时间点需根据细胞存活率、形态学特征及分子标志物 individually 设定。
   3. 处理结束前2 h，用4 µ37℃下使用CM-Dil荧光细胞示踪染料的摩尔浓度 °C 和 5% CO₂孵育2小时后，用0.05%胰蛋白酶-EDTA消化细胞，并将106个细胞重悬于50 μL中 µ酚红-PBS 溶液，注射前 L。
5. 显微注射癌细胞以形成异种移植瘤
   1. 将斑马鱼置于0.02%三卡因溶液中麻醉5分钟，直至其在琼脂平板上静止不动。
   2. 使用显微拉针仪（程序设置：P：300，Heat：260，Pull：60，VEL：50，Time：200）将外径（OD）为1.0 mm的玻璃毛细管拉制成微细毛细管。用注射器切割该微毛细管以形成锋利的边缘。将20 μL样品加载至微毛细管中 µ细胞/酚红-PBS 溶液 L。设定注射压力和时间，使每次注射量为 2 nL。
   3. 通过3到5次注射，每次注入6至10 nL，将100–200个细胞注入卵黄囊中。注射后，将鱼置于含有PTU溶液的5 mL新鲜Danieau's溶液中恢复10至30分钟。将鱼放入含PTU溶液的1 mL Danieau's溶液的24孔板中，于28.5℃孵育72小时。 °C.
   4. 孵育72小时后，用0.02%三卡因溶液麻醉斑马鱼，并用一滴3%甲基纤维素将其固定在玻片上。在620至750 nm波长下，通过荧光显微镜拍摄5倍放大图像。
   5. 使用 ImageJ 软件量化荧光肿瘤的大小。选择菜单 "分析 | 测量"保存与荧光信号对应的数值，并使用统计软件进行图形化分析。

结果

图1：斑马鱼异种移植实验整体流程的示意图。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
A549	ATCC	CCL-185	37 C°
RPMI 1640	Lonza	30096	4 C°
FBS	Biowest	S1520-500	-20 C°
青霉素-链霉素	Lonza	17-602E	-20 C°
细胞培养瓶 T25	SPL	70025	室温
细胞培养瓶 T75	SPL	70075	室温
细胞培养瓶 T175	SPL	71175	室温
1.5 ml 离心管	Extragene	Tube-170-C	室温
24 孔板	SPL	30024	室温
培养皿	SPL	10100	室温
PBS 溶液	Hyclone	SH30256.02	室温
胰蛋白酶-EDTA	Gibco	25-300-054	4 C°
氯化钠	Sigma-Aldrich	71382	室温
氯化钾 (KCl)	Sigma-Aldrich	P9541	室温
七水合硫酸镁 (MgSO4·7H2O)	Sigma-Aldrich	M2773	室温
四水合硝酸钙 (Ca(NO3)2·4H2O)	Sigma-Aldrich	C1396	室温
HEPES 溶液	Sigma-Aldrich	H0887	室温
甲磺酸艾莫宁 (Tricaine)	Sigma-Aldrich	E10521	室温
酚红溶液	Sigma-Aldrich	P0290	室温
甲基纤维素	Sigma-Aldrich	M0512	室温
1-苯基-2-硫脲 (PTU)	 Sigma-Aldrich	P7629	室温
CM-Dil 荧光染料	Invitrogen	C7001	-20 C°
玻璃毛细管	World Precision Instruments	TW 100F-4	室温
微电极拉制仪	Shutter instrument, USA	P-97	室温
显微注射仪	World Precision Instruments	PV820	室温
注射器	KOVAX	1ml	室温
微量移液器吸头	Eppendorf	5242956003	室温
载玻片	Marienfeld	HSU-1000612	室温
荧光显微镜	Leica	DE/DM 5000B	室温