体外光毒性检测：一种基于光动力疗法评估光敏剂在肺癌细胞中光毒性潜力的方法

摘要

来源：Chang, J. E., 等. 靶向肺癌纳米颗粒介导的光动力疗法的抗癌疗效 J. Vis. Exp. (2016)。

光动力疗法（PDT）是一种用于肺癌治疗的非侵入性、非手术方法。光敏剂可在肿瘤组织中选择性积累，并在氧气和适当波长的光照射下导致肿瘤细胞死亡。在本方案视频中，采用基于光动力疗法的方法来评估一种潜在光敏剂在肺癌细胞中的光毒性潜能。

方案

1. 透明质酸-神经酰胺（HACE）的合成

1. 溶解12.21 mmol的透明质酸（HA）寡聚物和9.77 mmol的四-n将氢氧化四丁基铵（TBA）溶于60 ml双蒸水（DDW）中，搅拌30分钟。
2. 合成DS-Y30连接子：将8.59 mmol DS-Y30神经酰胺和9.45 mmol三乙胺溶于25 ml四氢呋喃（THF）中，加入8.59 mmol 4-氯甲基苯甲酰氯的THF溶液，60 °C下搅拌反应6小时。
3. 将合成的8.10 mmol HA-TBA和0.41 mmol DS-Y30连接剂溶解于THF与乙腈的混合溶剂（4:1, v/v）中，在40 °C下搅拌反应5小时。
4. 使用助滤剂过滤去除杂质，通过减压蒸馏除去有机溶剂。利用透析膜（截留分子量：3.5 kDa）纯化产物，并进行冻干。

2. 纳米颗粒的制备

1. 将1 mg HB和1 mg紫杉醇溶解于0.5 ml二甲基亚砜（DMSO）中，并加入0.5 ml双蒸水（DDW），涡旋混合5分钟。然后，再通过涡旋混合5分钟，使HACE在该混合液中溶解。
2. 为去除溶剂，在氮气缓流条件下于70 °C加热4小时。
3. 用1 ml双蒸水（DDW）重新悬浮由HACE、HB和紫杉醇组成的薄膜。使用注射器滤器（孔径0.45 µm）过滤，以去除未包封的药物。

3. 体外 光毒性

1. 肺癌细胞系对纳米颗粒的摄取
   1. 配制含10% (v/v) 胎牛血清和1% (w/v) 青霉素-链霉素的RPMI-1640培养基。
   2. 将A549细胞以每孔1 × 10⁵ 个细胞的密度接种于24孔细胞培养板中（每组设三个复孔）。在37 °C、含5% CO₂ 和95%空气的湿润环境中培养24小时。
   3. 待细胞贴壁后，吸除培养基，并加入1 ml磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞。
   4. 将纳米颗粒溶于PBS中，配制成终浓度为2 µM/ml的HB溶液。随后，在每孔中分别加入1 ml PBS、空纳米颗粒（empty NPs）、HB-NPs或HB-P-NPs，避光孵育4小时。
   5. 吸除全部溶液，加入1 ml冷PBS洗涤细胞，重复洗涤一次。然后加入新鲜培养基。
2. 细胞活力检测
   1. 将细胞培养板置于PDT光纤下（PDT光纤距孔板距离为1 cm）。佩戴激光防护眼镜，在避光条件下使用PDT激光器（630 nm，400 mW/cm²）照射细胞，照射时间分别为0、5、10、20、30和40秒（对应的能量密度为0、2、4、8、12和16 J/cm²）。照射后，将细胞在避光条件下继续孵育24小时。
   2. 吸除培养基，加入1 ml冷PBS洗涤细胞，重复洗涤一次。
   3. 每孔加入10 µl细胞毒性检测试剂，避光孵育2小时。
   4. 使用酶标仪在450 nm波长处测定吸光度。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
寡聚透明质酸	Bioland Co., Ltd.
DS-Y30（神经酰胺3B；主要成分为油酰基-植烷鞘氨醇）	Doosan Biotech Co., Ltd.
己二酸二酰肼	Sigma Aldrich	A0638
N-(3-二甲氨基丙基)-N′- 乙基碳二亚胺	Sigma Aldrich	39391
4-(氯甲基)苯甲酰氯	Sigma Aldrich	270784
紫杉醇	泰华公司
注射器滤器	Sartorius Stedim Biotech GmbH	17762	15 毫米，RC，PP，0.45 µm
RPMI-1640	Gibco Life Technologies, Inc.	11875
青霉素–链霉素	Gibco Life Technologies, Inc.	15070
胎牛血清	Gibco Life Technologies, Inc.	16140071
硅藻土（助滤剂）	Sigma Aldrich	6858	参见步骤1.4