体内光动力疗法抗肿瘤疗效分析：一种评估光敏剂在荷瘤小鼠中光毒性潜能的技术

摘要

来源：Chang, J. E., 等. 靶向肺癌纳米颗粒介导的光动力疗法的抗癌疗效. J. Vis. Exp. (2016)。

光动力疗法（PDT）是一种用于肺癌治疗的非侵入性、非手术方法。光敏剂可在肿瘤组织中选择性积累，并在氧气和适当波长的光照射下导致肿瘤细胞死亡。本视频介绍了在荷瘤小鼠模型中使用含光敏剂的纳米颗粒进行体内抗肿瘤疗效分析，以评估该光敏剂的光毒性潜能。

方案

所有涉及动物的实验程序均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 透明质酸-神经酰胺（HACE）的合成

1. 将12.21 mmol的透明质酸（HA）寡聚物和9.77 mmol的四-n将氢氧化四丁基铵（TBA）溶于60 ml双蒸水（DDW）中，搅拌30分钟。
2. 合成DS-Y30连接子：将8.59 mmol DS-Y30神经酰胺和9.45 mmol三乙胺溶于25 ml四氢呋喃（THF）中，加入8.59 mmol 4-氯甲基苯甲酰氯的THF溶液，60 °C下搅拌反应6小时。
3. 将合成的8.10 mmol HA-TBA和0.41 mmol DS-Y30连接剂溶解于THF与乙腈的混合溶剂（4:1, v/v）中，在40 °C下搅拌反应5小时。
4. 使用助滤剂过滤去除杂质，通过减压蒸馏除去有机溶剂。利用透析膜（截留分子量：3.5 kDa）纯化产物，并进行冷冻干燥。

2. 纳米颗粒的制备

1. 将1 mg HB和1 mg紫杉醇溶解于0.5 ml二甲基亚砜（DMSO）中，并加入0.5 ml双蒸水（DDW），涡旋混合5分钟。然后，再通过涡旋混合5分钟，使HACE在该混合液中溶解。
2. 为去除溶剂，将溶液在氮气流下于70 °C加热4小时。
3. 用1 ml双蒸水（DDW）重新悬浮由HACE、HB和紫杉醇组成的薄膜，随后使用注射器滤器（孔径0.45 µm）过滤，以去除未包封的药物。

3. 在体 荷瘤小鼠中的抗肿瘤功效

1. 肺癌诱导小鼠模型
   1. 将 1 × 10⁶ 个 A549 细胞悬浮于 0.1 ml RPMI-1640 培养基中；置于冰上保存。
   2. 通过腹腔注射赛拉嗪与替拉明-唑拉西泮混合物（1:2，1 ml/kg）对小鼠进行麻醉。通过轻轻捏压小鼠皮肤皱褶判断麻醉效果。麻醉期间使用兽用眼膏涂抹眼睛，防止角膜干燥。
      注意：若无明显反应，则表明动物已充分麻醉，可开始实验。
   3. 将细胞悬液皮下注射至 BALB/C 雄性裸鼠左侧 flank 区域（6–7 周龄，20–22 g）。
   4. 持续观察小鼠，直至其在笼内恢复活动。
      注意：在动物未恢复足够意识以维持胸卧位前，不得无人看管。接受手术的动物在完全恢复前不得与其他动物合笼饲养。小鼠应饲养于特定病原体阴性（SPF）环境中。
   5. 每日使用游标卡尺测量肿瘤大小。肿瘤体积（mm³）按公式（长 × 宽²）/ 2 计算。当肿瘤体积达到约 200 mm³ 时，开始实验。
2. 抗肿瘤疗效研究
   1. 将小鼠随机分为 4 组（每组 n = 10）。
   2. 通过腹腔注射赛拉嗪与替拉明-唑拉西泮混合物（1:2，1 ml/kg）对小鼠进行麻醉。通过轻轻捏压小鼠皮肤皱褶判断麻醉效果。麻醉期间使用兽用眼膏涂抹眼睛，防止角膜干燥。
      注意：若无明显反应，则表明动物已充分麻醉，可开始实验。
   3. 将纳米颗粒溶于 PBS 中，使 HB 的终浓度为 2 mg/ml。于第 0 天和第 7 天通过尾静脉分别注射 PBS、游离 HB、HB-NPs 或 HB-P-NPs（HB 剂量为 2 mg/kg），各给药两次。
   4. 持续观察小鼠，直至其在笼内恢复活动。
      注意：在动物未恢复足够意识以维持胸卧位前，不得无人看管。接受手术的动物在完全恢复前不得与其他动物合笼饲养。保持笼具避光，并维持于 SPF 条件下。
   5. 每次注射后 24 小时，通过腹腔注射赛拉嗪与替拉明-唑拉西泮混合物（1:2，1 ml/kg）对小鼠进行麻醉。通过轻轻捏压小鼠皮肤皱褶判断麻醉效果。麻醉期间使用兽用眼膏涂抹眼睛，防止角膜干燥。
      注意：若无明显反应，则表明动物已充分麻醉，可开始实验。
   6. 将肿瘤部位置于 PDT 光纤下方（光纤与肿瘤表面距离为 1 cm）。佩戴激光防护眼镜，关闭开关后启动激光，使用 PDT 激光（630 nm，400 mW/cm²）照射肿瘤 500 秒（200 J/cm²），分别于第 1 天和第 8 天各照射一次。
   7. 持续观察小鼠，直至其在笼内恢复活动。在动物未恢复足够意识以维持胸卧位前，不得无人看管。接受手术的动物在完全恢复前不得与其他动物合笼饲养。
   8. 将笼具维持于 SPF 条件下。激光治疗后 24 小时内保持笼具避光。
   9. 每日肉眼观察肿瘤体积及肿瘤部位的变化。使用游标卡尺测量肿瘤大小，并按（长 × 宽²）/ 2（mm³）计算体积。每日拍摄肿瘤部位照片，以评估 PDT 后肿瘤表面的改变。
   10. 第 16 天，每组取五只小鼠，采用异氟烷深度麻醉法处死。
   11. 使用镊子和剪刀剪开体表皮肤，暴露肿瘤组织并小心剥离。将肿瘤组织置于 10% 福尔马林中固定，石蜡包埋后进行苏木精-伊红（H&E）染色，用于组织学分析。
   12. 持续观察 45 天后，采用异氟烷深度麻醉法处死剩余小鼠。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
寡聚透明质酸	Bioland Co., Ltd.
DS-Y30（神经酰胺 3B；主要成分为油酰基-植物鞘氨醇）	Doosan Biotech Co., Ltd.
己二酸二酰肼	Sigma Aldrich	A0638
N-(3-二甲基氨基丙基)-N′- 乙基碳二亚胺	Sigma Aldrich	39391
4-(氯甲基)苯甲酰氯	Sigma Aldrich	270784
紫杉醇	泰华公司
注射器滤器	Sartorius Stedim Biotech GmbH	17762	15 毫米，RC，PP，0.45 µm
RPMI-1640	Gibco Life Technologies, Inc.	11875
青霉素–链霉素	Gibco Life Technologies, Inc.	15070
胎牛血清	Gibco Life Technologies, Inc.	16140071
硅藻土（助滤剂）	Sigma Aldrich	6858	参见步骤1.4