肺部灌注与固定：通过气管引入液体并固定肺组织以测量固定肺容积

摘要

来源：Limjunyawong, N. 等，小鼠肺癌研究中常用的灌注与固定方法。J. Vis. Exp. (2015)。

本视频介绍了一种将液体注入气管以进行肺部灌注、固定及肺容积测量的简单且可靠的方法。

方案

所有涉及动物的实验程序均已通过当地机构动物护理委员会和JoVE兽医审查委员会的审核。

1. 肺部灌注

1. 选择一种商用的一英寸长 20 g 静脉导管用于插管。
2. 手动弯曲导管尖端，使其尖端形成轻微弯曲，如图 1所示。
3. 通过腹腔注射给予小鼠氯胺酮（100 mg/kg）和赛拉嗪（15 mg/kg）混合物进行麻醉，并通过缺乏反射性运动确认麻醉效果。麻醉后立即在眼睛上涂抹兽用眼膏，并皮下注射卡洛芬（5–10 mg/kg）以提供术后及灌注镇痛。
4. 将小鼠仰卧于一个倾斜的平台之上。如图 2所示，使用带有缝合环并用胶带固定的大型办公文件夹即可达到理想效果。
5. 剃除颈部腹侧的毛发，并用 70% 酒精清洁和消毒颈部区域。佩戴新的无乳胶、无粉手套，使用经 70% 酒精消毒的手术器械。
6. 使用锋利的剪刀在下门齿下方约 12 mm 处的颈部做一小切口。
7. 用镊子轻轻向尾侧牵拉颈部皮肤，直至可见气管腹壁。
8. 轻柔地向后牵拉舌头，将导管插入，使弯曲的尖端朝向小鼠腹面。如步骤 1.4 所述，轻柔牵拉颈部皮肤，并将导管插入气管。
   注意：稍加练习后，可观察到导管沿气管下行。若导管进入食管，则无法观察到其移动。切勿在气管上做任何切口。
9. 一旦在颈部观察到导管进入气管，继续推进约 5 mm，以确保其可靠通过声门但仍远高于隆突。
10. 准备通过凝胶上样移液器吸头经导管注入最多 50 µl 液体。将吸头插入鲁尔接头，但在注射前仔细观察吸头内液体是否随小鼠呼吸同步移动，确认无误后注入灌注液。
11. 使用 1 ml 注射器立即通过导管向肺内快速注入 0.6 ml 空气，以帮助液体深入肺部扩散。随后移除导管。
12. 移除导管。
13. 按照 VetBond 产品说明书的指示，使用少量氰基丙烯酸酯粘合剂闭合手术小切口。将小鼠放入单独的笼子中，并持续目视监测，直至其苏醒且行为正常，无任何不适表现。

2. 固定肺容积的测量

1. 使用阿基米德原理测量肺容积，如图所示 图3将固定好的肺组织从甲醛中取出，解剖并移除心脏及其他非肺组织。
2. 使用先前构建的简易自制金属丝支撑装置，以保持肺组织完全浸没在水中。
   注意： 该装置需要与所使用的天平兼容。图中所示为一种典型装置 图4 由塑料移液管和细金属丝（20 G）制成。该系统与视频中使用的天平配合良好，但也可轻松适配大多数实验室天平。
3. 放置一个烧杯 ≈在天平上放置盛有200 ml水的容器，并将支撑笼浸入水中后归零。见 图5移除金属笼；将肺置于水面，并用笼子将其压入水中。
4. 记录天平上的重量。该数值反映了被置换水的体积，因此可直接反映肺容积。注意确保肺、缝线或金属丝笼的任何部分均不接触烧杯的侧壁或底部。
5. 为确保准确性，需重复此测量步骤。将肺组织从水中取出，用纸巾擦干。重新将装有笼子的烧杯归零，再次测量肺体积。随后取两次体积测量值的平均值。
   注意： 如果肺脏在福尔马林中放置超过一周左右，肺内的空气将溶解于液体中。此时肺脏会下沉，因此不再需要使用任何装置来固定 图4 以保持肺组织完全浸没。在此情况下，可通过手持缝合线之一，将肺完全浸入液体中，如图所示，即可直接测量其体积。 图3.

结果

图1： 带有轻微弯曲尖端的静脉导管，用于滴注。

图 2： 使用倾斜的三环活页夹支撑小鼠进行插管。 该活页夹可同时固定 3 只小鼠。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
实验室天平	Ohaus	Adventurer Pro Model AV 313	若其他天平的量程为1-300 g，也可使用
20 g 鲁尔式静脉导管	Insylte		其他多个可能的供应商，例如 Jelco Optiva
500 ml 实验室瓶	Various		其他多个可能的供应商