低频超声应用：一种确定超声处理对人类白血病细胞影响的方法

摘要

来源：Trendowski, M. 等. 产生并定量分析脉冲低频超声以确定未经处理和经处理的肿瘤细胞的声敏感性。J. Vis. Exp. (2015)。

本视频介绍了利用低频超声选择性损伤人白血病细胞的方法。该低频超声技术在临床前研究中的应用 体外 该条件表明，可以通过细胞破坏来观察和比较超声处理对白血病细胞和正常细胞的影响。

方案

1. 细胞与培养基的准备

1. 使用 240 ml Iscove 改良杜尔贝科培养基（IMDM）和 50 ml 胎牛血清配制培养基。切勿将胎牛血清在热水浴中解冻，因为温度快速升高可能导致血清稳定性下降。在标准培养瓶中加入 240 µl 妥布霉素（50 mg/ml）和 5 ml 青霉素/链霉素（100×），然后加入培养基中。将培养基在 4°C 下保存。
2. 用已配制的培养基以约 4 × 10⁴ 个细胞/ml 的密度在 25 cm² 培养瓶中接种 U937 细胞。使用 TC20 细胞计数仪和台盼蓝染色排除法检测细胞浓度和活力：将 15–20 µl 细胞悬液与 15–20 µl 台盼蓝加入微量离心管中并混匀。用移液器吸取 15–20 µl 混合液加入 TC20 计数板，将计数板插入 TC20 细胞计数仪开始计数。
3. 将细胞在 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育，并使用台盼蓝染色排除法结合 TC20 细胞计数仪检测细胞活力。当细胞达到适当浓度和/或经声敏剂处理足够时间后，从培养瓶中转移 3 ml 细胞至 20 ml 玻璃闪烁瓶中。在本实验方案中，将 U937 细胞培养 48 小时，随后用 0.5、1 或 5 mM MeβCD 处理 30 分钟，以在超声处理前充分耗竭细胞内的胆固醇。

2. 细胞超声处理

1. 使用真空泵和布氏漏斗对去离子蒸馏水进行脱气处理。将水转移至杯状探头中，加水至探头顶部以上15 mm处。超声处理过程会使水进一步脱气，持续数分钟；如果在样品超声处理前未预先运行系统，可能导致实验过程中结果不一致。因此，在样品超声处理前应先运行系统约7分钟。
2. 将含有细胞的闪烁瓶固定在夹持装置上，然后将夹持装置连接至杯状探头顶部，并通过滑动装置调节至距探头顶部15 mm的高度（即与水面齐平）。
3. 通常采用三段超声脉冲处理细胞，每段持续1秒，脉冲之间间隔1秒。本实验方案中，使用上述脉冲剂量模式，在33%和50%振幅条件下分别对细胞进行超声处理。

3. 超声处理后评估细胞损伤

1. 使用台盼蓝和TC20细胞计数仪评估悬浮细胞的损伤情况和存活率。此外，使用Z2计数器分析样品。对于Z2计数器分析，将100 µl细胞悬液加入20 ml等渗盐水中（200:1比例）。分析前，使用等渗盐水至少冲洗Z2颗粒分析仪的孔径两次。将Z2样品放入计数器样品架中，并在开始计数前将平台升至孔径位置。
2. 使用制造商提供的软件从TC20和Z2计数器获取数据。分析这些数据以评估细胞损伤、存活率以及超声处理导致的细胞碎片产生情况。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
含碳酸氢钠的伊氏改良达耳伯科培养基 &和 25 mM HEPES	Life Technologies	12440079
胎牛血清	Sigma-Aldrich	12105
庆大霉素 50 mg/ml	Sigma-Aldrich	G1397
青霉素/链霉素 100倍溶液	Life Technologies	10378-016
Bio-Rad TC20 自动细胞计数仪	伯乐（Bio-Rad）	145-0102
台盼蓝溶液	Sigma-Aldrich	T8154
Falcon 50 ml &和 25 ml 带通气盖培养瓶	Fisher Scientific	353082
100 μ微量移液器	Wheaton	851164
1,000 μ微量移液器	Wheaton	851168
U937 人单核细胞白血病细胞	ATCC	CRL1593.2
THP1 人单核细胞白血病细胞	ATCC	TIB-202
Branson SLPe 40kHz 细胞破碎仪，配备 3" （25毫米）杯状角	Branson Ultrasonics	101-063-726	超声破碎仪
Beckman-Coulter Z2 细胞计数器配 AccuComp® 软件	贝克曼库尔特	6605700
Seal-Rite 1.5 ml 微量离心管	USA Scientific	1615-5510
Beckman-Coulter Accuvette ST 25 ml 小瓶及瓶盖	贝克曼库尔特	A35473
AccuJet Pro 自动移液器	BrandTech Scientific	26330
USA Scientific 10 ml 一次性血清移液管	USA Scientific	1071-0810
提示一 100 μl 和 1,000 μ滤器吸头	USA Scientific	1120-1840, 1126-7810
伯乐双室计数载玻片	Bio-Rad	145-0015
20 ml 玻璃闪烁瓶	Sigma-Aldrich	Z190527
Wheaton 250 ml 锥形瓶	Sigma-Aldrich	Z364827