溴脱氧尿苷脉冲标记实验：一种细胞增殖检测技术

摘要

来源：Welschinger R. 等。无需同步化的流式细胞术对细胞周期进程进行时间追踪。J. Vis. Exp. (2015)

该视频介绍了使用溴脱氧尿苷（BrdU）对哺乳动物细胞进行逐步脉冲标记的实验方法，用于检测细胞增殖。通过BrdU的摄取，可以在特定时间点追踪处于合成期的细胞，而无需对细胞进行同步化处理。

方案

1. 溶液与试剂

1. 完全 RPMI 培养基
   1. 向 500 ml 的 RPMI-1640 培养基中加入 56 ml 胎牛血清（FCS）和 5.5 ml 200 mM L-谷氨酰胺。
2. BrdU 储存液
   1. 在杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）中配制 32.5 mM BrdU（10 mg/ml）。
3. 含 BrdU 的完全 RPMI 培养基
   1. 将 6.2 µl BrdU 储存液加入 10 ml 完全 RPMI 培养基中。
4. DNase 溶液
   1. 在 DPBS 中配制 1 mg/ml DNase 溶液。
5. 染色缓冲液
   1. 在 DPBS 中配制含 3% 热灭活 FCS 和 0.09% 叠氮化钠的染色缓冲液。
6. 有关固定缓冲液、通透缓冲液和洗涤缓冲液的定义，请参见材料列表。

2. 细胞

注意：细胞培养时间不超过6个月。该方法可直接适用于任何非贴壁细胞系，只需对细胞密度和培养基进行相应调整。实验开始时应使用处于指数生长期的细胞。

1. 在T-75培养瓶中用完全RPMI培养基培养NALM6细胞。所有操作均须在II级生物安全柜中无菌条件下进行。
2. 每周分种培养三次，使NALM6细胞密度维持在每毫升1–2 × 10⁶ 个细胞之间。
3. 在37 °C、含5% CO₂ 的空气中孵育。

3. 使用 BrdU 对细胞进行脉冲标记

注意：操作 BrdU 时需谨慎，因其具有潜在的致突变性和致畸性。

1. 以 150 × g 离心 5 分钟。
   注意：将细胞转移至新鲜培养基中可提高实验结果的可重复性。
2. 进行细胞计数，并将细胞以完全 RPMI 培养基重悬至 2 × 10⁶ 个细胞/ml。
3. 用 BrdU 完全 RPMI 培养基将细胞按 1:2 稀释，使最终细胞浓度为 1 × 10⁶ 个细胞/ml。
4. 在 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育 45 分钟，然后用完全 RPMI 培养基按 1:10 稀释细胞。以 150 × g 离心 5 分钟，并小心弃去全部上清液。
5. 用少量完全 RPMI 培养基（约 100 µl）重悬细胞，进行细胞计数，并调整至 1 × 10⁶ 个细胞/ml。
6. 用移液器将 1 ml 细胞悬液加入 48 孔板的各孔中。向未使用的孔中加入 1 ml DPBS，以获得更可重复的结果。
7. 在 37 °C、5% CO₂ 及空气条件下孵育指定时间点，此处为 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23 和 24 小时。
   注意：孵育时间长度取决于实验设计所要测量的目标。
8. 用移液器将所有细胞转移至流式管中。依次用每份 1 ml 的 PBS 洗涤孔板，最终总体积达 5 ml。
9. 以 150 × g 离心 5 分钟，并小心移去全部上清液。细胞即可用于染色，请立即进行后续染色步骤（第 4 节）。

4. 细胞染色

注意：如果需要对细胞进行表面染色，应在固定前完成，并确保整个过程中细胞始终保存在 4 °C。

1. 用100 µl染色缓冲液重悬细胞（如需进行表面染色，可加入针对表面抗原的推荐用量抗体，在4 °C孵育30分钟）。
2. 加入1 ml染色缓冲液，于150 × g离心5分钟，弃去上清液。
   注意：具体抗体、浓度、孵育时间 etc. 将根据具体实验目的而有所不同。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
NALM6	DSMZ	ACC-128
5-溴-2′-脱氧尿苷	Sigma	B5002-1G
RPMI 1,640 不含 L-谷氨酰胺 500 ml	Lonza	12-167F
DPBS	Lonza	17-512F
胎牛血清	FisherBiotec	FBS-7100113
CO2 培养箱	Binder	C 150
BD Falcon 12 x 75 mm FACS 管	BD Biosciences	352008
BD LSR FORTESSA 流式细胞仪	BD Biosciences	FORTESSA
离心机	Spintron	GT-175R