BrdU免疫荧光染色：一种用于鉴定细胞周期不同阶段细胞的技术

摘要

来源：Welschinger, R.，等。无需同步化的流式细胞术对细胞周期进程进行时间追踪。J. Vis. Exp. (2015)。

本视频介绍了BrdU免疫荧光染色的实验方案。该技术可用于鉴定细胞周期不同阶段的细胞。通过添加DNA染料和抗体标记，可对S期细胞在后续时间点的命运进行详细分析。

方案

1. 溶液与试剂

1. 完全 RPMI 培养基
   1. 向 500 ml 的 RPMI-1640 培养基中加入 56 ml 胎牛血清（FCS）和 5.5 ml 200 mM L-谷氨酰胺。
2. DNase 溶液
   1. 用 DPBS 配制浓度为 1 mg/ml 的 DNase 溶液。
3. 染色缓冲液
   1. 用 DPBS 配制含 3% 热灭活 FCS 和 0.09% 叠氮化钠的溶液。
4. 固定缓冲液、通透缓冲液和洗涤缓冲液的定义请参见材料清单。

2. 细胞染色

注意：如果需要对细胞进行表面染色，请在固定前完成染色，并确保整个过程中细胞始终保存在 4 °C。

1. 将细胞重悬于 100 µl 染色缓冲液中（如需进行表面染色，加入针对表面抗原的推荐量抗体，并在 4 °C 下孵育 30 分钟）。
2. 加入 1 ml 染色缓冲液，以 150 × g 离心 5 分钟，弃去上清液。
   注意： 特异性抗体、浓度、孵育时间 等 将根据具体实验目的而有所不同。
3. 固定与通透
   1. 将细胞重悬于 100 µl 固定缓冲液中，在室温下孵育 15 分钟。
   2. 加入 1 ml 洗涤缓冲液，以 150 × g 离心 5 分钟，弃去上清液。
   3. 将细胞重悬于 100 µl 通透缓冲液中，冰上孵育 10 分钟。
   4. 加入 1 ml 洗涤缓冲液，以 150 × g 离心 5 分钟，弃去上清液。
   5. 每管中加入 100 µl 固定缓冲液重悬细胞，在室温下孵育 5 分钟。
   6. 加入 1 ml 洗涤缓冲液，以 150 × g 离心 5 分钟，弃去上清液。
      注意： 如有需要，可在本步骤暂停实验流程。若将固定后的细胞重悬于染色缓冲液中，可在 4 °C 下稳定保存数天。继续实验前，需在离心后去除染色缓冲液。
4. DNase 处理
   1. 将细胞重悬于 100 µl DNase 溶液中（每 10⁶ 个细胞加入 30 µg DNase），在 37 °C 下孵育 1 小时。
   2. 加入 1 ml 洗涤缓冲液，以 150 × g 离心 5 分钟，弃去上清液。
5. 抗体染色
   注意： 除 BrdU 外的其他细胞内标志物染色可与 BrdU 染色同时进行。
   1. 重要提示： 准备补偿对照，包括未染色细胞以及仅用单一荧光染料标记的细胞。理想情况下，补偿对照应使用与实验管中相同的抗体。若不可行，可选用针对高表达抗原、偶联相同荧光染料的替代抗体。
   2. 将细胞重悬于 50 µl 洗涤缓冲液中，每 10⁶ 个细胞加入 1 µl BrdU 抗体。
      注意： 也可同时加入针对其他特定细胞内抗原的直接偶联抗体。 
      注意： 可使用针对丝氨酸10位磷酸化的组蛋白 H3 的抗体来区分 G2 期与 M 期细胞，因为组蛋白 H3 在有丝分裂期间发生 Ser10 磷酸化。使用针对酪氨酸15位磷酸化的 cdc2 抗体可检测已进入有丝分裂的细胞。
   3. 在室温下孵育 20 分钟。
   4. 加入 1 ml 洗涤缓冲液，以 150 × g 离心 5 分钟，弃去上清液。

6. 进行细胞周期分析的DNA染色
   1. 轻轻悬浮沉淀，并加入20 µl 7-AAD溶液（0.25 µg）。
      注意： 必须使用恒定数量的7-AAD/细胞。
   2. 将细胞重悬于1 ml染色缓冲液中。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
APC BrdU 流式检测试剂盒	BD Biosciences	552598	包含 BrdU 抗体、7-AAD 和 BD Cytofix/Cytoperm 缓冲液（以下简称固定缓冲液）
BD Perm/Wash 缓冲液	BD Biosciences	554723	以下简称洗涤缓冲液
BD Pharmingen 染色缓冲液	BD Biosciences	554656
Pipetman 移液器	Gilson	P2, P20, P100, P1000
DNase	Sigma	D-4513
BD Cytoperm 增强型通透缓冲液	BD Biosciences	561651	以下简称通透缓冲液
离心机	Spintron	GT-175R
AF488 标记抗组蛋白 H3 磷酸化（Ser10）抗体	Cell Signalling	9708S
磷酸化 Chk2（Thr68）(C13C1) 兔单克隆抗体	Cell Signalling	2197S
磷酸化 Chk1（Ser345）(133D3) 兔单克隆抗体	Cell Signalling	2348S
BD Falcon 12 × 75 mm FACS 管	BD Biosciences	352008