白血病细胞与骨髓基质细胞的二维共培养：一种获取白血病细胞亚群的方法

摘要

来源：Slone, W. L. 等. 体外构建耐化疗白血病模型. J. Vis. Exp. (2016)。

本视频介绍了将白血病细胞与骨髓基质细胞进行长期二维共培养的技术，用于研究白血病细胞与骨髓微环境之间的相互作用。该二维共培养模型利用急性淋巴细胞白血病细胞与骨髓基质细胞或成骨细胞，以观察后者对肿瘤细胞表型的影响。本研究将有助于揭示在化疗药物作用下，骨髓微环境支持白血病细胞存活的相关机制。

方案

1. 高级准备

1. 培养骨髓基质细胞（BMSC）和成骨细胞（OB）。
   1. 将BMSC或OB在37 °C、6% CO₂ 条件下培养，接种于10 cm组织培养皿中，直至细胞融合度达到90%。
   2. 用胰蛋白酶消化BMSC或OB细胞，并按1:2比例传代至新的10 cm培养皿中。细胞按此标准培养，直至用于白血病细胞共培养实验。

2. 建立并维持共培养体系

1. 加入5-20 × 10⁶ 将白血病细胞以10 ml肿瘤特异性培养基接种至80%-90%融合度的BMSC或OB培养板中。
   注意： 本实验室在37 °C、5% O₂条件下维持共培养体系₂ 以更好地模拟骨髓微环境，其氧张力已被证实介于1%至7%之间。然而，在该氧张力下维持共培养物对于三种白血病亚群的建立并非关键，可由实验室自行决定。
2. 每4^th 第几天时，除去培养基中除1 ml（包含悬浮的白血病细胞）以外的全部液体，并补充9 ml新鲜的白血病细胞培养基。从培养板中移除9 ml培养基时，注意不要扰动贴壁的骨髓基质细胞（BMSC）或成骨细胞（OB）层。
   1. 倾斜培养板一侧以去除培养基，并吸取培养板角落处的培养基。此外，添加新鲜培养基时，务必沿培养板侧壁在角落处逐滴加入，以尽量减少对贴壁的骨髓间充质干细胞（BMSC）或成骨细胞（OB）层的干扰。
3. 12小时后^th 共培养当天，用移液器将培养基在培养皿表面轻轻吹打5至10次，冲洗白血病细胞使其脱离骨髓间充质干细胞（BMSC）或成骨细胞（OB）层，随后收集至15 ml锥形管中。按照步骤2.1所述方法，重新接种至新的、融合度达80%–90%的BMSC或OB培养板中。
   注意： 按照步骤2.3所述轻柔冲洗共培养体系，可去除悬浮的、相位明亮的白血病细胞，同时不破坏骨髓间充质干细胞（BMSC）或成骨细胞（OB）单层结构。此操作仅使肿瘤细胞转移至下一共培养培养板。该12天周期可根据用户需求重复多次。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
100 x 20 mm 细胞培养皿	Greiner Bio-One	664160
15 ml 锥形离心管	全球医疗产品	41021037	用于细胞收集
<强>培养基
成骨细胞培养基	PromoCell	C-27001	用于人成骨细胞培养基
RPMI 1640 培养基	Mediatech, Inc.	15-040	用于肿瘤培养基的制备
<强>贴壁细胞
人成骨细胞	PromoCell	C-12720	人骨成骨细胞的培养按照供应商提供的说明进行’s 的建议。
人类骨髓基质细胞	西弗吉尼亚大学生物样本中心		去身份化的原代人类白血病细胞和骨髓基质细胞（BMSC）由玛丽·巴布·兰道夫癌症中心（MBRCC）生物样本处理核心实验室和西弗吉尼亚大学病理学系组织库提供
<强>白血病细胞
REH	ATCC	ATCC-CRL-8286	REH 细胞的培养按照供应商说明进行’s 建议及推荐培养基。
SD-1	DSMZ	ACC 366	SD-1 按照供应商提供的说明进行培养’s 建议及推荐培养基。