白血病亚群收获：一种从二维共培养体系中空间分离白血病细胞亚群的方法

摘要

来源：Slone, W. L.，等。体外构建化疗耐药性白血病模型。J. Vis. Exp. (2016)。

本视频介绍了一种从二维共培养体系中空间分离三种白血病细胞亚群的方法：悬浮在培养基中自由漂浮的白血病细胞、黏附在间充质基质细胞单层表面的相亮白血病细胞，以及迁移至间充质基质细胞单层下方的相暗白血病细胞。

方案

1. 共培养物中分离3个亚群

1. 悬浮（S）肿瘤亚群的收集。
   1. 用移液器吸出共培养板中的培养基，并轻轻将同一培养基重新加入板中以冲洗，收集含有白血病细胞的培养基至15 ml锥形管中。所收集的白血病细胞即为S亚群。
2. 亮相（PB）肿瘤亚群的收集。
   1. 将10 ml新鲜培养基重新加入共培养板中。通过移液器反复吹打约5次，充分冲洗以去除贴壁的白血病细胞，但力度不宜过大，以免脱离贴壁的骨髓基质细胞/成骨细胞（BMSC/OB）组分。
   2. 用移液器吸出液体，并将培养基收集至15 ml锥形管中。所收集的细胞即为PB亚群。
3. 暗相（PD）肿瘤亚群的收集。
   1. 用1 ml PBS冲洗培养板以去除残留培养基。加入3 ml胰蛋白酶进行消化，并置于37 °C培养箱中孵育5 min。
   2. 将培养板从培养箱中取出，轻轻敲击板壁两侧，使贴壁的BMSC/OB细胞脱落。
   3. 加入1 ml胎牛血清（FBS），并吹打3–5次以分散大的细胞团块。
   4. 将含有细胞的液体收集至15 ml锥形管中。这些细胞为未纯化的PD亚群，其中也包含BMSC/OB细胞。
4. 将分离得到的3个亚群在400 × g离心7 min。吸除并弃去上清液，分别将沉淀重悬于1 ml预热的培养基中。细胞即可用于加载至G10柱中。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
50 ml 锥形离心管	World Wide Medical Products	41021039	细胞学标本保存液
15 ml 锥形离心管	Novacyt	NA	用于细胞收集
胎牛血清	Sigma	F6178
0.05% 胰蛋白酶	Mediatech, Inc	5229 TEC 5	25-053-CI
100 x 20 mm 细胞培养皿	Greiner Bio-One	664160
培养基
成骨细胞培养基	PromoCell	C-27001	用于人成骨细胞培养
RPMI 1640 培养基	Mediatech, Inc.	15-040	用于肿瘤细胞培养基制备
细胞系
人成骨细胞	PromoCell	C-12720	人成骨细胞按照供应商 的建议进行培养’
人骨髓基质细胞	WVU Biospecimen Core		去标识化的原代人白血病细胞和骨髓基质细胞（BMSC）由玛丽·巴布·兰道夫癌症中心（MBRCC）生物样本处理核心实验室和西弗吉尼亚大学病理学组织库提供。BMSC 培养物的建立方法如前所述 (*)
白血病细胞
REH	ATCC	ATCC-CRL-8286	REH 细胞按照供应商’的建议及推荐培养基进行培养
SD-1	DSMZ	ACC 366	SD-1 细胞按照供应商’的建议及推荐培养基进行培养