基于G-10柱的白血病细胞分选：一种从骨髓基质细胞中纯化急性淋巴细胞白血病细胞的方法

摘要

来源：Slone, W. L.，等。体外构建耐化疗白血病模型。J. Vis. Exp. (2016)。

本视频介绍了使用凝胶型十交联葡聚糖G-10柱从骨髓基质细胞中分离急性淋巴细胞白血病细胞的方法。该方法有助于回收已迁移至贴壁骨髓基质细胞层下方的肿瘤细胞群体，从而生成一个 "相位暗场" 肿瘤细胞群体。

方案

1. 将共培养细胞加载至G10柱

注意：在向G10层析柱中加入含细胞的培养基之前，务必确保旋塞完全关闭。此外，每个亚群必须分别通过独立的G10层析柱进行处理，以避免在后续分析中引入群体间的偏差。

1. 使用 1,000 µl 移液器，将每种细胞亚群在预热培养基中的 1 ml 逐滴加入到单独的 G10 柱中。确保含有细胞的培养基保持在 G10 沉淀物的上方或内部。在室温下孵育 20 分钟。
   注意：孵育期间旋塞保持关闭状态。

2. 从 G10 柱收集白血病细胞

1. 向每个G10柱中加入1-3 ml预热的培养基。打开旋塞阀，使培养基以逐滴方式缓慢流出。
   注意：必须保持柱子流出速度缓慢，否则含有BMSC/OB的G10沉淀物可能被冲出柱子，从而污染分离得到的白血病细胞。
2. 持续以小量（1-2 ml）向G10柱中添加预热的培养基，直至总共15至20 ml培养基流经柱子并被收集完毕。关闭旋塞阀，并盖上收集管盖。
   注意：若在收集管底部观察到G10颗粒沉淀，应轻柔地移除上清液，保留G10颗粒沉淀不受扰动，并将其转移至新管中。
3. 将收集的流出液在室温下以400 × g离心7分钟。弃去上清液，并将细胞沉淀重悬于适用于下游应用的缓冲液中。
4. 此时细胞为纯化的白血病细胞群体，不含BMSC或OB污染，可根据用户需要直接用于后续实验。
   注意：白血病细胞在通过G10柱后，其活力应保持不变。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
G10 Sephadex 微球	Sigma	G10120	文中称为交联葡聚糖凝胶10型颗粒
10 ml 无菌注射器	BD	309604
单向止流阀	World Precision Instruments, Inc.	14054-10
人成骨细胞	PromoCell	C-12720	人成骨细胞根据供应商’的建议进行培养
人骨髓基质细胞	WVU Biospecimen Core		去标识化的原代人白血病细胞和骨髓基质细胞（BMSC）由玛丽·巴巴布·兰道夫癌症中心（MBRCC）生物样本处理核心实验室和西弗吉尼亚大学病理学组织库提供。BMSC 培养物的建立方法如前所述 (*)
0.05% 胰蛋白酶	Mediatech, Inc.	25-053-CI
REH	ATCC	ATCC-CRL-8286	REH 细胞根据供应商’的建议和推荐培养基进行培养
玻璃棉	Pyrex	3950
50 ml 圆锥形离心管	World Wide Medical Products	41021039	用作收集管
15 ml 圆锥形离心管	World Wide Medical Products	41021037	用于细胞收集
胎牛血清	Sigma	F6178
SD-1	DSMZ	ACC 366	SD-1 根据供应商’的建议和推荐培养基进行培养
100 x 20 mm 细胞培养皿	Greiner Bio-One	664160