经眶后窦采血法：从小鼠眶后窦分离单个核细胞的方法

摘要

来源：Mopin A. 等。小鼠C1498细胞系及其相关白血病小鼠模型的详细表征方案。J. Vis. Exp. (2016)

该视频介绍了从小鼠眶后静脉窦采集外周血的取样方法，以及通过密度梯度离心法从血液中进一步分离单个核细胞的过程。

方案

1. 眼后静脉窦采血

1. 在层流罩内的无菌条件下，并在加热灯下防止低体温，于安乐死前进行眼后静脉丛采血。
2. 麻醉使用 150 mg/kg 的氯胺酮和 10 mg/kg 的赛拉嗪。通过将 1.5 ml 氯胺酮和 0.5 ml 赛拉嗪加入 18 ml PBS 溶液中配制麻醉液。
3. 将毛细管插入眼睛的内眦处。血液将从眶窦流入毛细管中。用无菌纱布轻轻按压眼球以控制出血。
   注意： 使用此技术可采集 100 至 200 µl 的血液。
4. 将血液收集至 EDTA 管中，并在分离单个核细胞前将样本置于冰上保存。

2. 血单个核细胞的分离

1. 将血液样本（100 至 200 µl；来自步骤 1.1）转移至微量离心管中，加入 PBS/1 mM EDTA 溶液，使总体积达到 500 µl。使用 30G 针头和 1 ml 注射器，将 500 µl 分离液小心地铺在含血液的溶液下方。切勿混合血液与分离液。
2. 将离心管在 800 × g 条件下（无刹车）室温离心 20 分钟。离心后，用移液器收集细胞环（不透明的白色层），并将细胞转移至另一微量离心管中。
   注意： 不透明的白色层含有淋巴细胞以及单核细胞，位于下层（分离液）与上层之间。
3. 加入 1 ml PBS 溶液，以 350 × g 离心 10 分钟。将细胞重悬于 600 µl FACS 缓冲液中。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
氯胺酮 1000 (100 mg/ml)	VIRBAC	3.59713E+12
赛拉嗪 SEDAXYLAN (20 mg/ml)	CEVA
PBS 溶液 (1x 浓度)	ThermoFisher Scientific	14190
超纯 0.5 M EDTA 溶液，pH 8.0	ThermoFisher Scientific	15575
分离液 (Pancoll Mouse)	PANBIOTECH	P04-64100
EDTA 管	Greiner Bio-One	454034
巴斯德吸管 150 mm (毛细管)	Fisherbrand	1154-6963
流式细胞术管 (蓝色)	Beckman Coulter	2523749
微量离心管 (1.5 ml)	ThermoFisher Scientific	05-408-129
无菌纱布海绵	URGO	501580
30 G 针头	Becton & Dickinson	304000
1 ml 注射器	Terumo	SS-01T
Shandon Cytospin 3 细胞离心涂片机	ThermoFisher Scientific