眶后血液采样:一种从小鼠眶后窦中分离单核细胞的方法

摘要

来源:Mopin A. et al. 表征小鼠 C1498 细胞系及其相关白血病小鼠模型的详细方案。J. Vis. Exp. （2016）

该视频描述了一种从小鼠眶后窦采集外周血并通过密度梯度离心从血液中进一步分离单核细胞的采样方法。

方案

1. 逆行眼眶采血

1. 在安乐死前，在无菌条件下，在层流罩和加热灯下进行逆眼眶采血，以防止体温过低。
2. 麻醉时，使用 150 mg/kg 的氯胺酮和 10 mg/kg 的甲苯噻嗪。通过在 18 ml PBS 溶液中稀释 1.5 ml 氯胺酮和 0.5 ml 甲苯噻嗪来制备麻醉溶液。
3. 将毛细管插入眼睛的内眦。血液将从眼眶窦上升到毛细管中。用无菌纱布海绵轻轻按压眼睛来控制出血。
   注意:使用该技术可以收集 100 至 200 μl 的血液。
4. 将血液收集到 EDTA 管中，并在分离单核细胞之前将样品储存在冰上。

2. 血液单核细胞的分离

1. 将血液样品（100 至 200 μl;从步骤 1.1 中获得）转移到微量离心管中，并加入 PBS/1 mM EDTA 溶液，直到溶液体积为 500 μl。使用 30G 针头和 1 ml 注射器，小心地将 500 μl 分离溶液分层在含有血液的溶液下。不要混合血液和分离液。
2. 在 RT 下以 800 x g （无制动器）离心管 20 分钟。离心后，使用移液管收集细胞环（不透明的白色层）。将细胞转移到微量离心管中。
   注意:不透明的白色层包含淋巴细胞和单核细胞，出现在下层 - 分离溶液 - 和上层之间。
3. 加入 1 ml PBS 溶液，并以 350 x g 离心管 10 分钟。将细胞重悬于 600 μl FACS 缓冲液中。

材料