May-Grunwald Giemsa 染色法：一种骨髓细胞染色方法

摘要

来源：Mopin, A. 等 小鼠C1498细胞系及其相关白血病小鼠模型的详细表征方案。J. Vis. Exp. (2016)。

本视频介绍了使用May-Grünwald Giemsa染色法对骨髓细胞进行染色的技术。在实验方案中，我们将对小鼠髓系白血病细胞C149细胞进行染色，以分析其形态学特征并进行分类计数。

方案

1. 体外 鉴定C1498细胞系

1. 体外 培养 C1498 细胞
   1. 通过向 500 ml RPMI（Roswell Park Memorial Institute）1640 培养基中加入 50 ml 胎牛血清（FBS）、5 ml 青霉素（100 U/ml）-链霉素（100 µg/ml）、500 µl 50 mM β-巯基乙醇、5 ml N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙烷磺酸（HEPES）、5 ml 非必需氨基酸和 5 ml 丙酮酸钠，配制完全 RPMI 培养基。
   2. 在完全 RPMI 培养基中培养 C1498 细胞系。通过移液收集悬浮细胞，并将细胞转移至 50 ml 离心管中。在 350 × g 条件下离心 10 分钟，弃去上清液。
   3. 加入 20 ml 磷酸盐缓冲液（PBS）（1×）溶液，在 350 × g 条件下离心 10 分钟，弃去上清液。
   4. 将细胞重悬于 10 ml 荧光激活细胞分选（FACs）缓冲液中（500 ml PBS 溶液中含 2.5 g 牛血清白蛋白（BSA）粉末和 2 ml 0.5 M 乙二胺四乙酸（EDTA）溶液）。用台盼蓝染色后，使用 Thoma 细胞计数板对细胞进行计数。

2. 显微镜用载玻片细胞悬液的制备

1. 用5 ml冷FACs缓冲液将步骤1.1.4中收获的10⁶ 个C1498细胞洗涤两次，然后将细胞重悬于1 ml冷FACs缓冲液中。将离心管置于冰上。
2. 将载玻片放入带有预装滤纸片的一次性染色缸中，并将染色缸放入细胞离心机内。
3. 向每个染色缸及滤纸片中加入100 µl FACs缓冲液，以4.52 × g离心2分钟。
4. 向每个染色缸及滤纸片中加入100 µl细胞悬液，以4.52 × g离心2分钟。
5. 小心从染色缸中取出载玻片，在用May-Grünwald Giemsa染色前使其自然干燥。

3. 瑞氏-吉姆萨（MGG）染色

1. 将载玻片浸入盛有迈-格染液的考普林瓶中，染色3分钟（细胞样品按第2节方法制备）。
2. 将载玻片转移至盛有pH 6.8缓冲液的考普林瓶中，处理1分钟。
3. 将载玻片放入盛有吉姆萨R染液（用pH 6.8缓冲液按1/20比例稀释）的考普林瓶中染色10分钟。随后用中性水（pH 7）冲洗载玻片10秒。
4. 沥干载玻片并自然晾干。在细胞区域滴加一滴封片介质2进行封片。用镊子夹取盖玻片，使其一侧边缘先接触载玻片，然后缓慢放下覆盖在细胞上。轻轻按压盖玻片以排除气泡。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
C1498细胞系	ATCC	TIB 49
2-巯基乙醇，Gibco	赛默飞世尔科技	21985
胎牛血清（FBS）	赛默飞世尔科技	10270
HEPES，Gibco（1 M）	赛默飞世尔科技	15630
青霉素-链霉素，Gibco	赛默飞世尔科技	15140
RPMI 1640 培养基（Gibco，含 GlutaMAX 补充物）	赛默飞世尔科技	61870
台盼蓝溶液（0.4 %）	赛默飞世尔科技	15250-061	浓度 1/2
室 &和过滤卡（EZ Cytofunnel Shandon）	赛默飞世尔科技	A78710003
五月-格ünwald 溶液	RAL Diagnostics	320070
吉姆萨R溶液	RAL 诊断	320310	浓度 1/20
pH 6.8 缓冲液	RAL 诊断	330368
载玻片（Starfrost - 磨边 90）	克尼特尔玻璃	VS1137# 077FKB
显微镜盖玻片，24 × 24 mm	克尼特尔玻璃	VD1 2424 Y100
Shandon Cytospin 3 细胞离心涂片机	赛默飞世尔科技