密度梯度离心:一种从外周血中分离 CLL 细胞的方法

Abstract

来源:Hay， J. et al. 原发性慢性淋巴细胞白血病细胞的亚细胞分级分离以监测核/细胞质蛋白运输。J. Vis. Exp. （2019 年）。

该视频介绍了从外周血中分离慢性淋巴细胞白血病 （CLL） 细胞的技术。通过该方案，我们将从人类患者血液样本中分离 CLL 细胞，以便随后有效生成细胞核和细胞质部分。

Protocol

1. 从患者血液样本中分离 CLL 细胞

来自
1. 先前同意的 CLL 患者的外周血样本从 EDTA 采血管中从诊所接收，并附有白细胞计数 （WCC）。根据 WCC 纯化外周血 CLL 样品。对于 WCC < 40 x 10⁶ 个细胞/mL，请继续执行步骤 1.1.1;对于 WCC ≥ 40 x 10⁶ 个细胞/mL，请继续执行步骤 1.1.2。
   1. 将所有 EDTA 血液管的内容物倒入 50 mL 锥形离心管中，每 1 mL 血液中加入 50 μL 人 B 细胞富集混合物。在室温 （RT） 下孵育 20 分钟。继续执行步骤 1.1.2。
   2. 用 RT CLL 洗涤缓冲液（磷酸盐缓冲盐水 （PBS）、0.5% 胎牛血清 （FBS） 和 2 mM EDTA）以 1:1 的比例稀释样品。
2. 将 RT 密度梯度培养基分装到适当大小的锥形离心管中，用于样品（10 mL 样品加入 50 mL 试管中，10 mL 样品中，4 mL 加入 15 mL 试管中，用于 10 mL 样品）。
3. 小心地将样品分层在密度梯度介质的顶部，并在 RT.
   下以 400 x g 离心 30 分钟 注意:在将样品放入离心机之前，请确保离心机处于 RT 状态，因为温度变化会导致单核细胞富集不良，并关闭离心机上的制动器，因为突然制动会破坏液体界面。
4. 使用塑料巴斯德移液管，将聚集在密度梯度培养基和 CLL 洗涤缓冲液界面处的白色单核细胞层轻轻收集到新鲜的 50 mL 锥形离心管中。
5. 向分离的单层中加入 40 mL CLL 洗涤缓冲液以洗涤细胞，并在室温下以 300 x g 离心 10 分钟。
6. 弃去上清液，轻弹试管底部重悬沉淀，然后重复步骤 1.5 中描述的洗涤步骤。
7. 弃去上清液，按照步骤 1.6 中的说明重悬沉淀，然后将沉淀重悬于一定体积的 CLL 洗涤缓冲液中（最多 40 mL，取决于细胞沉淀的大小）。
8. 使用台盼蓝和血细胞计数器对细胞进行计数。然后进行流式细胞术检查 CLL 细胞的纯度。
   注:在此阶段，CLL细胞可以以10 x 10⁶个细胞/mL的浓度在培养基中培养以用于实验，和/或在10%二甲基亚砜（DMSO）/FBS中冷冻保存以备将来使用，浓度高达100 x 10⁶个细胞/小瓶。

Materials