密度梯度离心法：从外周血中分离慢性淋巴细胞白血病细胞的方法

摘要

来源：Hay, J. 等. 慢性淋巴细胞白血病原代细胞的亚细胞组分分离以监测核/胞质蛋白转运。J. Vis. Exp. (2019)。

本视频介绍了从外周血中分离慢性淋巴细胞白血病（CLL）细胞的技术。通过本方案，我们将从人类患者血液样本中分离CLL细胞，用于后续高效制备细胞核和细胞质组分。

方案

1. 从患者血液样本中分离CLL细胞

1. 从已签署知情同意书的慢性淋巴细胞白血病（CLL）患者处获取临床送来的含EDTA抗凝管的外周血样本，并附带白细胞计数（WCC）。根据WCC纯化外周血CLL样本。若WCC < 40 × 10⁶ 个细胞/mL，则进入步骤1.1.1；若WCC ≥ 40 × 10⁶ 个细胞/mL，则进入步骤1.1.2。
   1. 将所有EDTA抗凝管中的内容物倒入一个50 mL圆锥形离心管中，每1 mL血液加入50 µL人B细胞富集试剂盒。室温（RT）孵育20分钟。进入步骤1.1.2。
   2. 以1:1比例用室温CLL洗涤缓冲液（磷酸盐缓冲液（PBS）、0.5%胎牛血清（FBS）和2 mM EDTA）稀释样本。
2. 根据样本体积，将适量室温密度梯度介质分装至适当大小的圆锥形离心管中（30 mL样本加入10 mL介质至50 mL管中，或10 mL样本加入4 mL介质至15 mL管中）。
3. 小心地将样本叠加在密度梯度介质上方，于室温下以400 × g 离心30分钟。
   注意： 确保离心前离心机已预平衡至室温，温度变化会导致单个核细胞富集效果不佳；同时关闭离心机刹车功能，因为突然刹车可能破坏液体界面。
4. 使用塑料巴氏吸管，小心吸取聚集在密度梯度介质与CLL洗涤缓冲液界面处的白色单个核细胞层，转移至新的50 mL圆锥形离心管中。
5. 向分离得到的细胞层中加入40 mL CLL洗涤缓冲液洗涤细胞，并于室温下以300 × g 离心10分钟。
6. 弃去上清液，通过轻弹管底重悬细胞沉淀，然后重复步骤1.5所述的洗涤步骤。
7. 弃去上清液，按步骤1.6所述方法重悬细胞沉淀，再将沉淀重悬于一定体积的CLL洗涤缓冲液中（最多40 mL，具体体积取决于细胞沉淀的大小）。
8. 使用台盼蓝染色和血细胞计数板进行细胞计数，随后进行流式细胞术检测CLL细胞纯度。
   注意： 在此阶段，CLL细胞可在实验所需培养基中以10 × 10⁶ 个细胞/mL的浓度进行培养，和/或以最高100 × 10⁶ 个细胞/管的浓度用含10%二甲基亚砜（DMSO）/FBS的冻存液冷冻保存，用于后续实验。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
15 mL 离心管	Griener Bio one	188271
1.5 mL 微量离心管	Griener Bio one	616201
DMSO	Sigma	D2650
EDTA	Sigma	EDS
胎牛血清	Thermofisher	10500064
Histopaque1077 密度梯度介质	Sigma	H8889
台盼蓝溶液	Thermofisher	15250061
PBS 片剂	Fisher Scientific	BR0014G
RosetteSep 人 B 细胞富集混合液	Stem Cell Technologies	15064
Sigma 3-16P	SciQuip		离心机