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1. 慢性淋巴细胞白血病细胞亚细胞组分的制备
注意： 设计实验方案时，应包括一孔未受刺激/未处理的细胞，用于制备全细胞提取物。
- 使用 10 – 20 × 106 个细胞/条件，对 MEC1 CLL 细胞系或分离的原代 CLL 细胞进行所需的刺激和/或药物处理。随后将细胞用于亚细胞组分分离或制备全细胞提取物，如下所述：
- 溶液/试管的准备： 在收获细胞当天，新鲜配制所有溶液/缓冲液。将溶液置于冰上保存，并在配制后 4 小时内使用。
- PBS/磷酸酶抑制剂溶液：通过将磷酸酶抑制剂以 1:20 的比例稀释于 1× PBS 中来配制（即，将 0.5 mL 磷酸酶抑制剂加入 9.5 mL 的 1× PBS 中）。
注意： 确保磷酸酶抑制剂未发生沉淀。若出现沉淀，于 50 °C 加热 10 分钟。
- 低渗缓冲液：通过将 10× 低渗缓冲液以 1:10 的比例稀释于蒸馏水中来配制 1× 低渗缓冲液（即，将 50 μL 的 10× 低渗缓冲液加入 450 μL 的 dH2O 中）。
- 10 mM 二硫苏糖醇（DTT）：通过将 1 M DTT 以 1:100 的比例稀释于蒸馏水中来配制 10 mM DTT（即，将 10 μL 的 1 M DTT 加入 990 μL 的 dH2O 中）。
注意： DTT 极不稳定，每次均需新鲜配制，避免反复冻融。
- 完全裂解缓冲液：确定每个实验所需的缓冲液体积。每个样品需要 50 μL 完全裂解缓冲液，因此向 44.5 μL 裂解缓冲液中加入 5 μL 的 10 mM DTT，再加入 0.5 μL 蛋白酶抑制剂混合物。根据实验中样品数量可按比例放大该体积。
- 为每种刺激和/或药物处理分别标记四组 1.5 mL 微量离心管，用于盛装新鲜刺激的细胞、新鲜制备的胞质组分、新鲜制备的核组分以及全细胞裂解物。将这些微量离心管预先置于冰上冷却，待用。
- 将细胞转移至分别标记的 1.5 mL 微量离心管中，于 4 °C 以 200 × g 离心 5 分钟形成沉淀。弃去上清液，将细胞沉淀重悬于 1 mL 冰冷的 PBS/磷酸酶抑制剂溶液中。再次于 4 °C 以 200 × g 离心 5 分钟，弃去上清液，将细胞沉淀置于冰上保存。
- 胞质组分的制备： 轻轻将用于亚细胞分离的细胞沉淀重悬于 50 μL 的 1× 低渗缓冲液中。冰上孵育 15 分钟，使细胞充分膨胀。
注意： 可根据细胞数量经验性地调整所用低渗缓冲液的体积。
- 向每个样品中加入 0.8 – 2.5 μL（1:20 至 1:60）去垢剂，并在最高转速下涡旋 10 秒。
- 为确定用于特定细胞类型以分离核与胞质组分的最佳去垢剂浓度，应首先进行去垢剂梯度实验。1:20 至 1:60 的范围（即，在 50 μL 低渗缓冲液中加入 2.5 μL 至 0.8 μL 去垢剂）通常足够。
注意： 若第 3.4 步中低渗缓冲液的体积有所调整，需确保维持相应的去垢剂比例。
- 使用相差显微镜在加入去垢剂前后观察细胞，以验证细胞裂解情况。完整细胞表现为体积较大，具有致密且深色的细胞核，胞质则呈现为围绕细胞核的明亮光环。
注意： 通过 Western 印迹分析由去垢剂梯度产生的裂解组分中的特定蛋白，可进一步确认裂解是否充分。
- 裂解完成后，于 4 °C 以 14,000 × g 离心 30 秒。
- 小心将上清液转移至预冷并标记的微量离心管中。此 胞质组分 可于 -80 °C 保存，待后续分析时使用。剩余沉淀含有核组分。
注意： 避免样品反复冻融。
- 核组分的制备： 通过移液吹打，将每个核沉淀重悬于 50 μL 完全裂解缓冲液中。
注意： 可根据起始细胞数量经验性地调整完全裂解缓冲液的体积。
- 加入 2.5 μL 去垢剂以溶解与核膜相关的蛋白，在最高转速下涡旋 10 秒，然后于冰上孵育 30 分钟。
- 在最高转速下涡旋 30 秒，随后于 4 °C 以 14,000 × g 离心 20 分钟。
- 将上清液转移至预冷并标记的微量离心管中。此 核组分 可于 -80 °C 保存，待后续分析时使用。
注意： 避免样品反复冻融。