细胞外通量测定：一种用于测量细胞代谢特征的方法

摘要

来源：Hlozkova K. 等。原代白血病细胞代谢谱的评估。J. Vis. Exp. (2018)。

本方案提供了一种利用细胞外通量分析法测定原代白血病细胞胞外酸化率（ECAR）和氧消耗率（OCR）的生化方法。对这些细胞代谢特征的评估有助于明确其代谢需求，从而实现个体化治疗。

方案

1. 试剂的准备

1. 将137 mM NaCl、2.7 mM KCl、4.3 mM Na₂HPO₄ 和 1.47 mM KH₂PO₄ 溶解于ddH₂O中，配制500 mL PBS。用HCl调节pH至7.4。通过高压灭菌进行灭菌。
2. 配制100 mL RPMI培养基：RPMI-1640培养基含L-丙氨酰-谷氨酰胺，并添加10%胎牛血清（FBS）、青霉素（100 U/mL）和链霉素（100 μg/mL）。
3. 在蒸馏水中配制50 mL 0.1 M NaHCO₃ 。调节pH至8.1，经滤膜（0.22 μm）过滤除菌，4 °C保存。
   注意： 对于两个8孔细胞外通量分析板，需配制250 μL pH为8.1的0.1 M NaHCO₃ 。
4. 在蒸馏水中配制1 mL 2 M D-葡萄糖溶液。经滤膜（0.22 μm）过滤除菌，-20 °C保存。
5. 在乙醇中配制100 μL 1 mM 寡霉素A（Oligomycin A）溶液。经滤膜（0.22 μm）过滤除菌，-20 °C保存。
6. 在Minimal DMEM（Dulbecco改良Eagle培养基）中配制250 μL 1 M 2-脱氧-D-葡萄糖（2-DG）溶液。加热至37 °C并调节pH至7.4（在37 °C下进行pH测定）。经滤膜（0.22 μm）过滤除菌，-20 °C保存。
7. 在DMSO中配制100 μL 1 mM FCCP（羰基氰化对-三氟甲氧基苯腙）溶液。经滤膜（0.22 μm）过滤除菌，-20 °C保存。
8. 在乙醇中配制100 μL 1 mM 鱼藤酮（Rotenone）溶液。经滤膜（0.22 μm）过滤除菌，-20 °C保存。
9. 在乙醇中配制100 μL 1 mg/mL 抗霉素A（Antimycin A）溶液。经滤膜（0.22 μm）过滤除菌，-20 °C保存。
10. 使用前立即配制10 mL 糖酵解应激测试培养基。将Minimal DMEM在水浴中预热至37 °C，并调节pH至7.4（在37 °C下进行pH测定）。
11. 使用前配制10 mL 含BSA的细胞线粒体应激测试培养基。在Minimal DMEM中添加2 mM L-谷氨酰胺、10 mM D-葡萄糖、1 mM HEPES（pH 7.4）、1 mM 丙酮酸钠和0.1% BSA（牛血清白蛋白）。将培养基在水浴中预热至37 °C，并调节pH至7.4（在37 °C下进行pH测定）。
12. 使用前配制10 mL 不含BSA的细胞线粒体应激测试培养基。在Minimal DMEM中添加2 mM L-谷氨酰胺、10 mM D-葡萄糖、1 mM HEPES（pH 7.4）和1 mM 丙酮酸钠。将不含BSA的细胞线粒体应激测试培养基在水浴中预热至37 °C，并调节pH至7.4（在37 °C下进行pH测定）。
    注意：在细胞线粒体应激测试培养基中添加BSA，是因为当培养基中含有BSA时，细胞对FCCP的反应更佳（已测试不同条件）。不含BSA的细胞线粒体应激测试培养基用于加样孔的加载，因为制造商不建议在加样孔中使用含BSA的培养基。

2. 单个核细胞的过夜培养

注意：所有子步骤均须在无菌细胞培养罩内进行。

1. 准备两个T75培养瓶，每瓶加入20 mL RPMI培养基。向每个培养瓶中加入30 × 10⁶ 分离得到的单个核细胞。将培养瓶直立放置，于5% CO₂ 、37 °C条件下孵育16–24小时。

3.  细胞粘附涂层培养板的制备

1. 包被两块8孔细胞外通量分析仪板。
   注意：包被操作需在无菌细胞培养超净台中进行。
2. 将2.2 μL细胞黏附剂（浓度：2.54 mg/mL）加入250 μL的0.1 M NaHCO₃溶液（pH 8.1）中，立即用移液器将12.5 μL该溶液加入每个孔中。
   注意：不同批次的细胞黏附剂原液浓度可能不同，应相应调整加入NaHCO₃ 的体积。
3. 将板置于超净台中静置约20分钟，然后吸除细胞黏附剂溶液，每孔用200 μL无菌水洗涤两次。打开盖子继续在超净台中静置，直至孔内干燥。
4. 立即使用或在4 °C保存最多1周，保存时需用石蜡膜包裹边缘以防止冷凝。接种细胞前，确保将板在超净台中恢复至室温（约20分钟）。

4. 传感器盒的水合

注意：水合两块 8 孔细胞外通量分析仪检测板。

1. 将工具板与传感器盒分开。将传感器盒倒置放在实验台上。
2. 向工具板的每个孔中加入 200 μL 校准液。向孔周围外侧的护 moat 中各加入 400 μL 校准液。
3. 将传感器盒放回已装有校准液的工具板中。
4. 将盒组件置于加湿、无 CO₂、37 °C 的培养箱中过夜。
5. 打开细胞外通量分析仪，使其在 37 °C 下预热过夜。

5. 在细胞粘附涂层培养板中接种细胞

注意：进行糖酵解应激测试时，使用糖酵解应激测试培养基；进行细胞线粒体应激测试时，使用含BSA的细胞线粒体应激测试培养基。

1. 在不同的培养板中分别接种用于糖酵解压力测试和细胞线粒体压力测试的细胞。每次测试使用来自一个培养瓶的过夜培养细胞。
2. 在室温下以 200 × g 离心 5 分钟，收集细胞。用 1 mL 相应培养基重悬细胞并进行计数。
3. 将 4 × 10⁶ 个活细胞加入至终体积为 400 μL 的培养基中（使用适当的培养基）。
4. 将 50 μL 细胞悬液接种至 B-G 列的孔中。确保每孔接种 500,000 个细胞。
   注意：每孔必须精确接种 500,000 个细胞，因为实验未进行其他归一化处理。这样可确保不同患者样本之间的结果具有可比性。建议设置六个重复孔，如本文所述。不建议减少重复次数，因为原代细胞有时可能出现异常行为。
5. 向 A 列和 H 列的孔中各加入 180 μL 相应培养基（这些孔将用于背景校正）。
6. 将培养板在室温下以 400 × g 离心 5 分钟，刹车设置为 1。
7. 向两个 8 孔细胞外通量分析仪板的 B-G 列孔中缓慢而小心地加入 130 μL 相应培养基。在显微镜下观察，确认细胞已稳定贴附于孔底。
8. 将培养板置于 37 °C、无 CO₂、加湿的培养箱中孵育 30 分钟。

6. 加载传感器盒

1. 进行糖酵解应激测试时，分别准备250 μL的100 mM葡萄糖、20 μM寡霉素A和1 M 2-DG，均用糖酵解应激测试培养基配制。
2. 进行细胞线粒体应激测试时，分别准备250 μL的20 μM寡霉素A、15 μM FCCP、30 μM FCCP，以及10 μM鱼藤酮和10 μg/ml抗霉素A的混合液，均用不含BSA的细胞线粒体应激测试培养基配制。
   注意：建议在一次检测中注入两种浓度的FCCP，因为患者样本量不足以进行FCCP滴定。然而，具体浓度应由研究人员自行确定。
3. 将化合物按以下方式（表1）加入微孔板相应的加样端口：

7. 设置程序

1. 对于糖酵解压力测试，按照 表2中描述的设置程序。
2. 对于细胞线粒体压力测试，按照 表3中描述的设置程序。
3. 启动程序。当系统提示时，将校准板更换为检测板。

端口	糖酵解压力测试		细胞线粒体压力测试
	加入端口的试剂	孔中最终浓度	加入端口的试剂	孔中最终浓度
A	20 μL 的 100 mM 葡萄糖	10 mM 葡萄糖	20 μL 的 20 μM Oligomycin A	2 μM Oligomycin A
B	22 μL 的 20 μM Oligomycin A	2 μM Oligomycin A	22 μL 的 15 μM FCCP	1.5 μM FCCP
C	25 μL 的 1 M 2-DG	100 mM 2-DG	25 μL 的 30 μM FCCP	4.5 μM FCCP
D	X		25 μL 的 10 μM Rotenone 和 10 μg/ml Antimycin A	1 μM Rotenone 和 1 μg/ml Antimycin A

表1：化合物体积。

步骤	设置
校准	自动
平衡	自动
基线测量	三次：混合 – 3 分钟，等待 – 0 分钟，测量 – 3 分钟
A 口注入	注入
测量	三次：混合 – 3 分钟，等待 – 0 分钟，测量 – 3 分钟
B 口注入	注入
测量	三次：混合 – 3 分钟，等待 – 0 分钟，测量 – 3 分钟
C 口注入	注入
测量	四次：混合 – 3 分钟，等待 – 0 分钟，测量 – 3 分钟

表2：糖酵解应激测试程序。

步骤	设置
校准	自动
平衡	自动
基线测量	三次：混合 – 3 分钟，等待 – 0 分钟，测量 – 3 分钟
A 通道进样	进样
测量	三次：混合 – 3 分钟，等待 – 0 分钟，测量 – 3 分钟
B 通道进样	进样
测量	三次：混合 – 3 分钟，等待 – 0 分钟，测量 – 3 分钟
C 通道进样	进样
测量	三次：混合 – 3 分钟，等待 – 0 分钟，测量 – 3 分钟
D 通道进样	进样
测量	三次：混合 – 3 分钟，等待 – 0 分钟，测量 – 3 分钟

表3：细胞线粒体应激测试程序。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Seahorse Analyzer XFp	Agilent Technologies	S7802A
Seahorse XFp 细胞培养微型板	Agilent Technologies	103025-100
Corning™ Cell-Tak 细胞和组织粘附剂	ThermoFisher Scientific	CB40240
D-(+) 葡萄糖	Sigma-Aldrich	G7021-100G
寡霉素 A	Sigma-Aldrich	75351-5MG
2-脱氧-D-葡萄糖	Sigma-Aldrich	D8375-1G
FCCP	Sigma-Aldrich	C2920-10MG
鱼藤酮	Sigma-Aldrich	R8875-1G
链霉菌来源的抗霉素 A	Sigma-Aldrich	A8674-25MG
Seahorse XF 基础培养基，100 mL	Agilent Technologies	103193-100
L-谷氨酰胺溶液，200 mM	Sigma-Aldrich	G7513-100ML