T细胞富集：利用磁性分离技术从混合细胞群体中分离T细胞的方法

摘要

来源：Nguyen, H. D.，等。用于研究树突状细胞在移植物抗宿主病中作用的骨髓移植平台。J. Vis. Exp. (2020)。

本视频介绍了通过磁性分离器利用负向选择法从小鼠脾脏中富集T细胞的技术。该技术通过使用针对特定细胞表面抗原的抗体或配体，靶向去除样本中的其他细胞，从而实现T细胞的富集。

方案

所有涉及动物模型的操作均已经过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 第1天：从供体小鼠中分离T细胞

1. 使用 CD45.2⁺ H2k^b+ C57BL/6 野生型（WT）小鼠作为 T 细胞的供体。
2. 通过二氧化碳（CO₂）窒息法处死 C57BL/6 小鼠，并等待 2−3 分钟直至其失去意识。必要时采用颈椎脱位法作为二次安乐死措施。
3. 用 70% 乙醇彻底清洁小鼠的毛发和皮肤。取出脾脏和淋巴结，并使用注射器活塞和 40 µm 细胞筛将其研磨成单细胞悬液。用 1% RPMI（含 1% FBS 的 RPMI 培养基）冲洗细胞筛和注射器活塞，以收集全部脾细胞。
4. 将细胞悬液在 4 °C 条件下以 800 x g 离心 5 分钟。弃去上清液后，加入 5 mL ACK 裂解缓冲液（1 mM Na₂EDTA、10 mM KHCO₃、144 mM NH₄Cl，pH 7.2），室温孵育 5 分钟。
   注意：ACK 裂解缓冲液用于裂解红细胞。
5. 加入 5 mL 1% RPMI 以终止裂解反应。在 4 °C 条件下以 800 x g 离心 5 分钟，弃去上清液。
6. 配制冰冻的磁珠激活细胞分选（MACS）缓冲液（含 0.5% BSA 和 2 mM EDTA 的 PBS，pH 7.2）。使用前对缓冲液进行脱气处理。将细胞沉淀重悬于 5 mL MACS 缓冲液中。
7. 使用血细胞计数板和 1% 台盼蓝染色对脾细胞进行计数并检测活细胞率。保留 2 × 10⁶ 个细胞的等分试样，用于通过流式细胞术分析评估纯化得率。
8. 将脾细胞重悬于 MACS 缓冲液中，浓度为 200 × 10⁶/mL。每 10⁶ 个细胞加入 0.03 µL 生物素标记抗小鼠 Ter-119 抗体、0.03 µL 生物素标记抗小鼠 CD11b 抗体、0.03 µL 生物素标记抗小鼠 CD45R 抗体和 0.03 µL 生物素标记抗小鼠 DX5 抗体。在 4 °C 条件下孵育 15 分钟。
   注意： 生物素标记抗小鼠 Ter-119、抗小鼠 CD11b、抗小鼠 CD45R 和抗小鼠 DX5 分别用于结合红系细胞、粒细胞、B 细胞和 NK 细胞，因此这些细胞亚群将在后续步骤中被去除。
9. 向细胞悬液中加入 10 mL 冰冻的 MACS 缓冲液。在 4 °C 条件下以 800 x g 离心 5 分钟，弃去上清液。
10. 将细胞沉淀重悬于 MACS 缓冲液中，浓度为 100 × 10⁶/mL。向脾细胞悬液中加入抗生物素微珠（0.22 µL/10⁶ 个细胞），充分混匀后在 4 °C 条件下继续孵育 15 分钟。用 10 mL 冰冻的 MACS 缓冲液洗涤细胞悬液一次。在 4 °C 条件下以 800 x g 离心 5 分钟，弃去上清液。
11. 将磁性分离柱置于磁场中。用 3 mL MACS 缓冲液冲洗分离柱。将细胞悬液缓慢滴加至分离柱上。收集流穿液，其中含有未结合的、富集的 T 细胞，收集至新的 15 mL 圆底离心管中。用 3 mL 冰冻的 MACS 缓冲液洗涤 MS 柱。
    注意： 在进行洗涤步骤前，确保分离柱已完全排空。
12. 将细胞悬液在 4 °C 条件下以 800 x g 离心 5 分钟。将细胞沉淀重悬于 5 mL MACS 缓冲液中。
13. 使用血细胞计数板和 1% 台盼蓝对细胞进行计数。保留 2 × 10⁶ 个细胞的等分试样，用于通过流式细胞术检测纯度。
    注意： 采用该方法每只小鼠平均可获得约 20−25 × 10⁶ 个脾脏 T 细胞。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
RPMI 1640	Thermo Fisher Scienctific	11875-093	培养基
MidiMACS	Miltenyi Biotec	130-042-302	T细胞富集
0.5 M EDTA  pH 8.0 100ML	Fisher Scientific	BP2482100	MACS缓冲液
10X PBS	Fisher Scientific	BP3994	MACS缓冲液
Anti-Biotin MicroBeads	Miltenyi Biotec	130-090-485	T细胞富集
Anti-Human/Mouse CD45R (B220)	Thermo Fisher Scientific	13-0452-85	T细胞富集
Anti-Mouse CD4 Biotin	Thermo Fisher Scientific	13-0041-86	T细胞富集
CD11b	Thermo Fisher Scientific	13-0112-85	T细胞富集
CD25-biotin	Thermo Fisher Scientific	13-0251-82	T细胞富集
CD45R	Thermo Fisher Scientific	13-0452-82	T细胞富集
CD49b  单克隆抗体 (DX5)-生物素	Thermo Fisher Scientific	13-5971-82	T细胞富集
Anti-Mouse TER-119 Biotin	Thermo Fisher Scientific	13-5921-85	T细胞富集
Anti-mouse CD45.1 PE	Thermo Fisher Scientific	12-0900-83	流式细胞术分析
C57BL/6小鼠	Charles River	27	供体/受体
流式细胞术管	Fisher Scientific	352008	流式细胞术分析
40 µm细胞筛	Thermo Fisher Scientific	22363547	细胞制备