骨髓来源的树突状细胞生成:一种从小鼠骨髓生成树突状细胞的方法

摘要

来源:Nguyen， H. D.， et al. 骨髓移植平台研究树突状细胞在移植物抗宿主病中的作用。J. Vis. Exp..（2020 年）。

该视频描述了从成年小鼠的骨髓中产生树突状细胞（激活 T 细胞的关键抗原呈递细胞）的方案。

方案

1. 生成骨髓来源的树突状细胞 （BM-DC）。

1. 从 WT 或因子 B （fB） ^{- / -} 小鼠的股骨和胫骨中分离骨髓 B6 背景。简而言之，使用镊子和剪刀从双腿收集胫骨和股骨。将它们放入 50 mL 锥形管中，加入含有 1% FCS 和 100 U/mL 青霉素/链霉素和 2 mM L-谷氨酰胺 （1% RPMI） 的冰冷 RPMI 中。使用镊子和剪刀去除所有肌肉组织，彻底清洁股骨和胫骨。将股骨和胫骨从 50 mL 锥形管转移到直径为 92 mm 的含有 1% RPMI 的培养皿中。用剪刀剪断股骨或胫骨的末端。用 25 mL 的 1% RPMI 1640 培养基填充 50 mL 试管。使用该方法将 3 mL 1% RPMI 填充到 26 G 针头上的 3 mL 注射器中。将此注射器插入骨骼中并推动柱塞，以 1% RPMI（~3 mL/骨骼）将骨髓 （BM） 从腔中冲洗到收集管中。将细胞以 800 x g 旋转 5 分钟。
将
2. 沉淀重悬于 5 mL ACK 裂解缓冲液中，用于红细胞裂解。将细胞悬液在冰上孵育 5 分钟。向细胞悬液中加入 10 mL 的 1% RPMI 以停止裂解，并在 4 °C 下以 800 x g 离心 5 分钟。弃去上清液。
将
3. 细胞沉淀重悬于 10 mL 培养基（含有 10% FBS、100 U/mL 青霉素/链霉素、2 mM l-谷氨酰胺和 50 mM β-巯基乙醇）中的细胞沉淀，并调节体积以满足 2 x 10⁶ 个细胞/mL 的最终浓度。
4. 向细胞悬液中加入 20 ng/mL 粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 （GM-CSF）。在 37 °C 和 5% CO₂ 的 100 x 15 mm 培养皿中培养骨髓细胞 6 天。
5. 第 3 天，用含有 40 ng/mL GM-CSF 的新鲜培养基（约 5 mL）替换一半正在进行的培养基（约 5 mL）。
6. 在 37 °C 的水浴中预热培养基。从骨髓培养皿中收集约 5 mL 的培养基。在 4 °C 下以 800 x g 离心 5 分钟。弃去上清液。将细胞沉淀重悬于含有 40 ng/mL GM-CSF 的 5 mL 培养基中。
7. 在培养的第 6 天向培养基中加入 25 μg/mL 脂多糖 （LPS） 以使 BM-DC 成熟。保存 2 x 10⁶ 个细胞的等分试样，以通过流式细胞术确定 DC 分化功效。
8. 收集成熟的 BM-DC:使用细胞提升器从培养皿中轻轻刮下 DC。将所有细胞悬液收集在 50 mL 锥形管中。以 800 x g 离心，在 4 °C 下离心 5 分钟。弃去上清液。用 50 mL 冰冷的 PBS 洗涤细胞沉淀 3 次。保存约 2 x 10^{个 6} BM-DC，用于通过流式细胞术进行免疫表型分析。

材料