骨髓来源树突状细胞的制备：一种从小鼠骨髓生成树突状细胞的方法

摘要

来源：Nguyen, H. D., 等 用于研究树突状细胞在移植物抗宿主病中作用的骨髓移植平台。J. Vis. Exp. (2020)。

本视频介绍了一种从小鼠成年小鼠骨髓中生成树突状细胞的实验方案——树突状细胞是激活T细胞的关键抗原呈递细胞。

方案

1. 生成骨髓来源的树突状细胞（BM-DCs）。

1. 从B6背景的野生型（WT）或因子B（fB）^-/- 小鼠的股骨和胫骨中分离骨髓。简言之，使用镊子和剪刀取下双侧后肢的胫骨和股骨，放入含有1% FCS、100 U/mL青霉素/链霉素及2 mM L-谷氨酰胺的冰上预冷RPMI培养基（1% RPMI）中，置于50 mL锥形管内。用镊子和剪刀彻底清除股骨和胫骨上的肌肉组织。将股骨和胫骨从50 mL锥形管转移至直径为92 mm、盛有1% RPMI的培养皿中。用剪刀剪去股骨或胫骨两端，向50 mL管中加入25 mL 1% RPMI 1640培养基，并用其填充一支连接26 G针头的3 mL注射器（含3 mL 1% RPMI）。将注射器插入骨髓腔，推动活塞将骨髓（BM）冲洗至含有1% RPMI的收集管中（约3 mL/骨）。在800 x g 条件下离心5分钟。
2. 将细胞沉淀重悬于5 mL ACK裂解缓冲液中以裂解红细胞，冰上孵育5分钟。向细胞悬液中加入10 mL 1% RPMI终止裂解反应，于4 °C、800 x g 离心5分钟，弃去上清液。
3. 将细胞沉淀重悬于10 mL培养基（含10% FBS、100 U/mL青霉素/链霉素、2 mM L-谷氨酰胺和50 mM β-巯基乙醇的RPMI 1640）中，并调整体积使细胞终浓度达到2 × 10⁶ 个细胞/mL。
4. 向细胞悬液中加入20 ng/mL粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF），将骨髓细胞接种于100 × 15 mm培养皿中，在37 °C、5% CO₂ 条件下培养6天。
5. 在第3天更换一半原有培养基（约5 mL），补充含40 ng/mL GM-CSF的新鲜培养基。
6. 将培养基在37 °C水浴中预热，从骨髓培养皿中收集约5 mL培养基，在4 °C、800 x g 条件下离心5分钟，弃去上清液，将细胞沉淀重悬于5 mL含40 ng/mL GM-CSF的培养基中。
7. 在培养第6天向培养基中加入25 µg/mL脂多糖（LPS）以诱导BM-DC成熟。保留一份含2 × 10⁶ 个细胞的等分试样，用于通过流式细胞术检测树突状细胞（DC）的分化效率。
8. 收集成熟的BM-DC：使用细胞刮轻轻刮下培养皿中的DC，将所有细胞悬液收集至50 mL锥形管中，在4 °C、800 x g条件下离心5分钟，弃去上清液。用50 mL冰上预冷的PBS洗涤细胞沉淀3次，保留约2 × 10⁶ 个BM-DC用于通过流式细胞术进行免疫表型分析。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
10X PBS	Fisher Scientific	BP3994	MACS 缓冲液
B6 fB-/- 小鼠	中佛罗里达大学	本实验室自繁	受体
B6.Ly5.1 (CD45.1 + ) 小鼠	查尔斯河实验室	546	供体
BALB/c 小鼠	查尔斯河实验室	28	移植受体
C57BL/6 小鼠	查尔斯河实验室	27	供体/受体
胎牛血清 (FBS)	Atlanta Biologicals R&D system	D17051	细胞培养
脂多糖 (LPS)	Millipore Sigma	L4391-1MG	树突状细胞成熟
New Brunswick Galaxy 170R 培养箱	Eppendorf	Galaxy 170 R	细胞培养
青霉素+链霉素（10,000 单位青霉素 / 10,000 mg/ml 链霉素）	GIBCO	15140	培养基
RPMI 1640	赛默飞世尔科技	11875-093	培养基