染色质免疫沉淀实验：一种用于研究细胞内蛋白质-DNA相互作用的技术

摘要

来源：Fuchs, A. R.,等 染色质免疫沉淀实验鉴定慢性淋巴细胞白血病中新的NFAT2靶基因。J. Vis. Exp. (2018)。

本视频介绍了染色质免疫沉淀（ChIP）实验的方案，这是一种用于证明蛋白质与DNA相互作用的经典技术。该技术可用于鉴定人类慢性淋巴细胞白血病细胞中的靶基因。

方案

1. 染色质免疫沉淀

注意：染色质免疫沉淀使用市售的 ChIP 试剂盒进行，按照制造商提供的说明书进行操作，并进行了修改。

1. 计算免疫沉淀反应的数量（剪切后的染色质：Jurkat细胞为70 µL，患者样本为15 µL，每反应加入一种抗体），并在1.5 mL离心管中为每次沉淀准备20 µL蛋白A包被磁珠。每沉淀用40 µL 1× ChIP缓冲液1通过移液吹打洗涤磁珠，将磁珠置于磁力架上静置1分钟，然后用移液器吸除上清液。此步骤共重复四次。最后，将磁珠用原始体积的1× ChIP缓冲液1重悬。
2. 免疫沉淀实验本身，请使用10 µg αNFAT2抗体（7A6）捕获NFAT2及其结合的靶序列。使用2.5 µg兔IgG抗体（DA1E）作为IgG对照。按照所示，在新的1.5 mL离心管中配制反应体系。 表1.
   注意： 使用单克隆抗体时，应选择具有高亲和力且其表位在固定过程中不被遮蔽的抗体，这对本实验方案至关重要。多克隆抗体会引入额外的变异性，使实验结果的准确解读变得显著困难。
3. 将步骤1.2中的混合物置于4 °C、6 rpm的旋转仪上孵育过夜。
4. 第二天，将离心管在7,000 x g下离心5秒 g 在小型离心机中短暂离心后，将样品置于磁力架上孵育1分钟，随后用移液器吸除上清液。依次用洗涤缓冲液1、2、3和4各洗涤磁珠一次。
5. 为此，将磁珠重悬于350 µL洗涤缓冲液中，置于4 °C、6 rpm的旋转轮上孵育5分钟。
6. 随后，将离心管在7000 x g下离心5秒。 g 在小型离心机中离心。然后将样品置于磁力架上1分钟，移除上清液，并加入下一步洗涤缓冲液。
7. 最后一次洗涤步骤后，用移液器吸除上清液，将磁珠重悬于100 µL洗脱缓冲液1中，在6 rpm转速的旋转仪上孵育30分钟。
8. 短暂离心管子（5 秒，7000 x g 在小型离心机中离心后，将样品置于磁力架上静置1分钟。
9. 然后用移液器将上清液转移至新的1.5 mL离心管中，并加入4 µL洗脱缓冲液2。
10. 为制备输入对照，将1 µL剪切后的染色质与99 µL洗脱缓冲液1和4 µL洗脱缓冲液2混合（在此实验设置中，每位患者对应三个试管：一个输入对照、一个IgG对照和一个αNFAT2样品）。
11. 在1.5 mL离心管中，于65 °C、1300 rpm条件下孵育样品4小时。加入100 µL 100%异丙醇，涡旋混匀后在7000 × g下离心5秒。 g 在小型离心机中。
12. 充分涡旋重悬磁珠，向每个样本中加入10 µL磁珠，并在室温下以6 rpm于旋转仪上孵育1小时。
13. 孵育后，将离心管在7000 x g下离心5秒 g 将离心管放入小型离心机中，然后置于磁力架上1分钟。用移液法吸除上清液。
14. 将珠子重悬于100 µL洗涤缓冲液1中。倒置离心管混匀，于室温下在6 rpm的旋转轮上孵育5分钟。
15. 将离心管在7000 x g下离心5秒 g 在小型离心机中短暂离心后，将样本置于磁力架上1分钟，用移液器吸除上清液。使用洗涤缓冲液2重复步骤2.13–2.14。
16. 随后，用移液法吸除洗涤缓冲液，将磁珠重悬于55 µL洗脱缓冲液中，在6 rpm转速的旋转仪上室温孵育15分钟，以洗脱沉淀的DNA。最后，在7000 x g条件下离心5秒 g 在小型离心机中离心后，将样本置于磁力架上1分钟，然后将上清液转移至新的1.5 mL离心管中。
    注意： 此处可选择暂停实验流程。洗脱的DNA应保存在-20 °C。

项目	每次免疫沉淀的体积 (µL)
5% BSA	6
100 x 蛋白酶抑制剂	3
5 x ChIP 缓冲液 1	56
剪切后的染色质	x (15 µL 或 70 µL)
包被蛋白A的磁珠	20
ChIP-seq 级水	185-x-y
抗体 (αNFAT2 或 IgG 对照)	y (1.09 µL 或 1 µL)
总计	270

表1：染色质免疫沉淀的移液时间表。染色质免疫沉淀通过按照表中所示准备反应体系来进行。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
抗NFAT2抗体	Alexis	1008505	克隆株 7A6
抗NFAT2抗体	Cell Signaling	8032S	克隆株 D15F1
ChIP级抗NFAT2抗体	Abcam	ab2796	克隆株 7A6
磁力架，DynaMag-15 磁铁	Thermo Scientific	12301D	可用类似仪器替代
组蛋白ChIP-seq理想试剂盒	Diagenode	C01010059
小型离心机	Thermo Scientific	Heraeus Fresco 17	可用类似仪器替代
摇床 Duomax 1030	Heidolph Instruments	543-32205-00	可用类似仪器替代
Halt蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物（100X）	Thermo Scientific	78440
IRDye 680LT 驴抗兔IgG（H + L），0.5 mg	LI-COR Biosciences	926-68023
IRDye 800CW 山羊抗小鼠IgG（H + L），0.1 mg	LI-COR Biosciences	925-32210
DNA LoBind 1.5 mL 离心管	eppendorf	22431021
优质FBS	Merck	S0615
37% 甲醛 p.a., ACS	Roth	4979.1
1 × PBS	Sigma Aldrich	D8537
M220 聚焦超声破碎仪	Covaris	500295
20X Bolt MES SDS 电泳缓冲液	Thermo Scientific	B0002
Tris缓冲盐水（TBS-10X）	Cell Signaling	#12498
iBlot 2 蛋白转印装置	Thermo Scientific	IB21001
iBlot 2 转印叠片，硝酸纤维素膜，标准尺寸	Thermo Scientific	B23001
大型离心机	Eppendorf	5804R	可用类似仪器替代