所有涉及人类参与者的操作均按照机构、国家和国际的人类福利指南进行,并已通过当地机构审查委员会的审查。
1. 骨髓穿刺与样本制备
- 患者与材料准备
- 使用16号针头将1%利多卡因注入一个或两个10 mL注射器中,然后更换为21号针头。
- 在表面皿上滴加两滴5% EDTA。
- 准备载玻片(n=15,编号与患者编号及日期保持一致),用于涂片制备。
- 将患者置于侧卧位,定位髂后上棘,并用笔做标记。
注意: 通常情况下,髂后上棘位于髂嵴远端约一手宽、中线外侧约一手宽处。在女性中,该骨性标志可能略偏外侧,而在部分男性中可能略偏内侧。
- 用含0.5-1%氯己定的乙醇溶液以目标活检区域为中心向外环形消毒皮肤。
- 打开无菌手套包装,戴上无菌手套,并将包装纸平铺于桌面以建立无菌区域。打开穿刺针包装,并将其放置于无菌区域内。
- 浸润皮肤、皮下组织,最终至骨膜。在骨膜处注射利多卡因,确保直径约1 cm的区域被充分麻醉。
注意: 对骨膜充分注射利多卡因是保障患者舒适度的最重要因素之一。可通过穿刺针轻敲目标活检部位并询问患者是否感到疼痛,来测试骨膜是否已充分麻醉。需注意:儿童在整个操作过程中均接受全身麻醉。
- 用手掌和食指握住穿刺针(15 Ga × 2.8"),食指置于针体金属杆侧面靠近针尖处;此握持方式可提供更好的控制力。
- 通过旋转动作(快速交替进行旋前/旋后运动)将针穿过皮肤,朝向髂棘推进,并使针尖接触髂后上棘。
- 确保针进入已麻醉的骨膜区域;此时患者应仅感受到压力而无疼痛感。若患者感到疼痛,应重新调整针的位置或追加利多卡因注射。
- 施加轻柔但坚定的压力,同时以顺时针-逆时针交替旋转的方式推进穿刺针。通常当阻力减小时,提示针已进入骨髓腔。
- 从针中取出针芯,将一个10 mL空注射器连接至穿刺针上。
- 通过轻柔回拉注射器活塞产生负压。提前告知患者在抽取骨髓时可能会感到抽筋样感觉或疼痛。若未获得足够的骨髓小粒,可再进行一次快速抽吸。大多数骨髓小粒存在于首次回抽所得的前1-2 mL样本中。仅抽取1-2 mL,以避免样本稀释。
注意: 样本稀释会导致血液稀释,可能干扰微小残留病(MRD)检测结果。
- 取下注射器,重新插入针芯。将部分骨髓排入表面皿,其余部分排入一支8 mL肝素抗凝管中。
注意: 每当骨髓样本进入标本管后,应立即轻轻颠倒混匀,以确保充分抗凝。骨髓凝固常是导致样本不合格的原因。可从同一穿刺点再次抽取额外骨髓,但更推荐在原位置前进5-10 mm后再进行新的抽吸。建议每次穿刺深度最多不超过两次抽吸。务必对采集管按顺序编号,以标识第一次、第二次或后续抽吸所得样本。通常惯例是将首次抽吸样本用于最重要的诊断分析。
- 或者,可将针从原穿刺点退出,再于原穿刺点数毫米外重新进入骨髓腔,并重复操作。
注意: 每次抽吸量不应超过1-2 mL,以避免显著的血液污染。
- 根据所需材料量重复操作。当已获取满足特定临床研究方案所需的足够材料后,拔出骨髓穿刺针。
注意: 若骨髓抽吸缓慢或困难,使用预先用抗凝剂冲洗过的注射器可能有所帮助。若出现“干抽”(dry tap),应进行骨髓活检(trephine biopsy),此操作不在本文范围之内。
2. 形态学检查涂片的制备
- 为获得最佳的形态学评估效果,从表面皿中的穿刺物中挑取骨髓小粒(例如使用塑料刮刀),并将其置于载玻片上。
- 将另一张载玻片轻轻覆盖在含有骨髓的载玻片上,轻轻滑动;避免施加任何压力。
注意:仅在骨髓小粒非常大的情况下,可施加轻微压力,以减少细胞涂片的厚度。此操作过程中若有助手协助处理标本管将更为便利。准确标记标本管上的患者编号及连续骨髓穿刺的序号至关重要。
- 将涂片彻底干燥后,进行瑞氏-吉姆萨-格朗沃尔特染色(见材料表)。在光学显微镜下观察细胞形态(见 图1)。
注意:图1A 显示的是由多种功能细胞类型组成的正常骨髓涂片,而 图1B 为急性髓系白血病(AML)患者的涂片,主要为白血病原始细胞。为了更准确地界定残留白血病负荷,需进行免疫表型分析。