磁激活细胞分选：分离c-Kit阳性细胞的方法

摘要

来源：Kesarwani, M.，等。评估 c-Fos 和 Dusp1 在癌基因依赖性中作用的方法。J. Vis. Exp. (2019)。

本视频介绍了从小鼠骨髓中分离 c-kit 阳性细胞的技术。在该实验方案中，我们将从转基因小鼠中分离 c-kit 阳性细胞，以验证 c-Fos 和 Dusp1 单独或联合作为白血病药物靶点的可行性。

方案

所有涉及动物模型的操作均已被当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会审核。

从骨髓中分离 c-Kit⁺ 细胞

1. 根据机构指南处死小鼠。
   注意： 此处，小鼠暴露于二氧化碳（CO₂）中，气体流速按照美国兽医医学协会（AVMA）推荐的标准进行，直至呼吸和心跳停止确认死亡，随后进行颈椎脱位。
2. 从小鼠体内取出腿部骨骼 ——两根股骨、两根胫骨、两块髂骨。用解剖刀刮除骨骼上附着的所有组织。将腿部骨骼放入含5 mL冰冷1×PBS的15 mL离心管中，置于冰上。将管内内容物倒入研钵中，用研杵充分研磨粉碎。
3. 使用移液管将细胞悬液通过70 µm细胞筛过滤至带有10 mL移液管的50 mL螺口离心管中。用冰冷的1×PBS多次冲洗研钵和研杵，收集冲洗液并加入50 mL离心管中。在4 °C下以1,200 × g 离心5分钟，收集骨髓细胞。用连接真空系统的玻璃移液管吸除上清液 via 。用移液管将细胞沉淀重悬于5 mL 1×PBS中。
4. 用移液管将悬浮的骨髓细胞缓慢加至5 mL室温（温度至关重要）的多蔗糖溶液顶部，注意不要破坏液面界面。关闭刹车，在室温下以400 × g 离心20分钟。
5. 用移液管收集浑浊的总单核细胞（TMNC）界面层，转移至新的15 mL离心管中。用1×PBS补总体积至10 mL用于洗涤，取20 µL进行细胞计数，然后在4 °C下以1,200 × g 离心5分钟。弃去上清液，将细胞沉淀保存在冰上，用于步骤4.6.1。
6. 进行c-Kit⁺ 细胞分离。
   1. 按照磁珠试剂盒说明书进行c-Kit⁺ 细胞分离。将细胞沉淀重悬于80 µL含EDTA和BSA的1×PBS中，细胞密度为10⁷ 个细胞。向细胞悬液中加入20 µL CD117 MicroBeads/10⁷ 总细胞。充分涡旋混匀，在4 °C孵育10分钟。加入含EDTA和BSA的1×PBS至总体积10 mL，在4 °C下以1,200 × g 离心5分钟。
   2. 用真空系统吸除上清液，将细胞沉淀重悬于500 µL/10⁸ 总细胞的含EDTA和BSA的1×PBS中。将磁柱安装于磁力架上，加入3 mL含EDTA和BSA的1×PBS，依靠重力使其流过磁柱，收集于15 mL收集管中。
   3. 当第一份缓冲液完全流过磁柱后，将细胞悬液加至磁柱中，依靠重力使其流过 via 磁柱，流入15 mL收集管中。此穿流液为不需要的细胞组分。
   4. 每次用3 mL含EDTA和BSA的1×PBS洗涤磁柱3次，每次均依靠重力使其流过 via 磁柱进入收集管。将磁柱从磁力架上取下，置于15 mL离心管顶部。
   5. 加入5 mL含EDTA和BSA的1×PBS，并立即使用配套推杆快速冲洗磁柱。取出推杆，再用额外5 mL含EDTA和BSA的1×PBS重复冲洗一次。使用标准方法对总体积中的细胞进行计数。
   6. 在4 °C下以1,200 × g 离心细胞5分钟。弃去上清液，将沉淀重悬于完全IMDM培养基（IMDM + 10% FBS + IL-6 [10 ng/mL] + mSCF [50 ng/mL] + FLT3配体 [20 ng/mL] + IL-3 [10 ng/mL]）中进行培养。将细胞以2 × 10⁶ 个细胞/1 mL完全IMDM培养基的密度接种，置于37 °C、5% CO₂培养箱中过夜培养。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
生物材料
IMDM	Cellgro (corning)	15-016-CVR
重组小鼠 SCF	Prospec	CYT-275
重组小鼠 Flt3-配体	Prospec	CYT-340
重组小鼠 IL-6	Prospec	CYT-350
重组小鼠 IL-7	Peprotech	217-17
FBS	Atlanta biological	S11150
PBS	Corning	21040CV
70 μm 尼龙细胞筛	Becton Dickinson	352350
LS 柱	Miltenyi	130-042-401
EDTA	Ambion	AM9261
BSA	Sigma	A7906
研钵和研杵	Coor tek	60316 和 60317
CD117 MicroBead 试剂盒	Miltenyi	130-091-224
磁力架	Miltenyi