磁激活细胞分选:一种分离 c-Kit 阳性细胞的方法

摘要

来源:Kesarwani， M. 等人<a href="https://www.jove.com/t/58194">评估 c-fos 和 dusp1 在癌基因依赖性中的作用的方法。J. Vis. Exp. （2019 年）。

该视频介绍了从小鼠骨髓中分离 c-kit 阳性细胞的技术。在该方案中，我们将从转基因小鼠中分离 c-kit 阳性细胞，以验证 c-Fos 和 Dusp1 单独或一起作为白血病的药物靶标。

方案

所有涉及动物模型的程序均已由当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会审查。

从骨髓中分离 c-Kit⁺ 细胞

1. 根据机构指南处死小鼠。
   注:在这里，根据 AVMA 推荐的流速将小鼠暴露于二氧化碳 （CO₂） 中，直到通过呼吸和心跳停止确定死亡，然后是颈椎脱位。
2. 从老鼠身上收获腿骨——两个股骨、两个胫骨、两个髂骨。用手术刀刮掉骨头上的所有组织。将腿骨放入冰上的 1x PBS 中 — 5 mL 装在 15 mL 试管中。将管子里的东西倒入研钵中，用杵压碎。
3. 使用移液管，通过 70 μm 细胞过滤器将细胞悬液过滤到 50 mL 螺旋盖管中，并连接 10 mL 移液器。用冷的 1x PBS 多次清洗研钵和研杵，收集细胞悬液并将其添加到 50 mL 试管中。在 4 °C 下以 1,200 x g 旋转骨髓 5 分钟。通过附有玻璃移液管的真空吸尘器去除上清液。用移液管将细胞沉淀悬浮在 5 mL 的 1x PBS 中。
4. 用移液管将悬浮的骨髓缓慢添加到 5 mL 室温（温度至关重要）聚蔗糖的顶部，非常小心不要干扰界面。在室温下以 400 x g 旋转 20 分钟，同时关闭制动器。
5. 用移液管收集混浊的总单核细胞 （TMNC） 界面，并将其放入新的 15 mL 试管中。用 1x PBS 将体积调至 10 mL进行洗涤，取 20 μL 进行计数，并在 4 °C 下以 1,200 x g 旋转 5 分钟。弃去上清液，将沉淀保存在冰上以进行步骤 4.6.1。
6. 进行 c-Kit⁺ 细胞分离。
   1. 遵循微珠试剂盒方案进行 c-Kit⁺ 细胞分离。将细胞沉淀重悬于 80 μL 1x PBS + EDTA + BSA 中至 10⁷ 个细胞中。向细胞悬液中加入 20 μL CD117 MicroBeads/10⁷ 个总细胞。涡旋充分混合，并在 4 °C 下孵育 10 分钟。通过添加 1x PBS + EDTA + BSA 使体积达到 10 mL，并在 4 °C 下以 1,200 x g 旋转 5 分钟。
   2. 通过真空除去上清液，并将细胞沉淀悬浮在 500 μL/10⁸ 个总细胞中，溶于 1x PBS + EDTA + BSA 中。使用附有磁柱的磁架，加入 3 mL 1x PBS + EDTA + BSA，并使其通过重力流入 15 mL 收集管中。
   3. 第一次缓冲液添加完通过色谱柱后，将细胞悬液添加到色谱柱中，使其通过重力流入 15 mL 收集管。该流出物是不需要的细胞组分。
   4. 每次用 3 mL 1x PBS + EDTA + BSA 洗涤色谱柱 3 次，使其通过重力流入收集管。从磁力架上取下色谱柱，并将其放在 15 mL 试管的顶部。
   5. 加入 5 mL 的 1x PBS + EDTA + BSA，并立即用色谱柱随附的柱塞冲洗。取下柱塞并用额外的 5 mL 1x PBS + EDTA + BSA 重复冲洗。使用标准方法对总体积中的细胞进行计数。
   6. 在 4 °C 下以 1,200 x g 的速度离心细胞 5 分钟。去除上清液并将沉淀重悬于完全 IMDM 中（IMDM + 10% FBS + IL-6 [10 ng/mL] + mSCF [50 ng/mL] + FLT3 配体 [20 ng/mL] + IL-3 [10 ng/mL]）中用于培养。将这些细胞置于 37 °C 和 5% CO₂ 的培养箱中，在 2 x 10⁶ 个细胞/1 mL 细胞 IMDM 完全培养基中培养过夜。

材料