逆转录病毒介导的转导：一种将目的基因导入癌细胞的方法

摘要

来源：Kesarwani, M., 等. 评估 c-Fos 和 Dusp1 在癌基因依赖性中作用的方法. J. Vis. Exp. (2019)。

本视频介绍了通过逆转录病毒在慢性髓系白血病细胞系中转移目的基因以进行基因验证的实验方案。逆转录病毒作为媒介，通过称为转导的过程将遗传物质导入白血病细胞，从而实现目的基因的长期表达。该方法可应用于任何目的细胞，用于基因功能验证及治疗开发。

方案

1. 转导

1. 逆转录病毒质粒转染
   1. 前一天下午在37 °C水浴中快速解冻HEK293细胞。将含有HEK细胞的冻存管以435 x g 室温孵育3分钟，弃上清液 通过 用真空吸去液体，加入1 mL添加有10% FBS、青霉素、链霉素和谷氨酰胺的DMEM重悬细胞沉淀。
   2. 计数细胞，并加入适量体积至10 cm处理过的培养皿（约4 × 10⁶细胞）⁶ HEK293T 细胞）。向培养皿中加入 14 mL DMEM 10 培养基，通过上下轻柔晃动充分混匀以确保分布均匀。将培养皿置于 37 °C、5% CO₂ 培养箱中₂ 培养箱中孵育过夜。
   3. 次日早晨，在倒置显微镜下观察细胞汇合度（50%或以上较为适宜）。
   4. 将DNA（目标逆转录病毒质粒）、PclEco（包装质粒）、2 M CaCl₂₂，和 H₂0，置于1.5 mL离心管中（总体积为500 µL），使用微量移液器加入以下成分：7.5 µg DNA（BCR-ABL1-YFP）、7.5 µg pCLeco、62 µL 2 M CaCl₂₂，加水至终体积为500 µL。另取一支1.5 mL离心管，加入500 µL的2×HBS。
   5. 将DNA混合液逐滴加入含有500 µL 2x HBS（280 mM NaCl，100 mM HEPES，1.5 mM Na₂HPO₄在混合的同时，将涡旋振荡器调至最低转速，将 HBS 管置于其上以保持持续混匀，同时加入转染混合物。
   6. 将转染混合物在室温下孵育20–30分钟。孵育期间，向HEK细胞中加入25 nM氯喹，并将细胞放回培养箱中。孵育结束后，将转染混合物逐滴加入HEK细胞中，然后轻轻晃动培养液，使转染混合物在培养板中均匀混合。
   7. 将细胞与混合液在37 °C、5% CO₂条件下孵育约8 h₂ 培养箱。通过缓慢加入14 mL新鲜DMEM 10培养基更换这些细胞的培养液。将移液管沿培养皿壁缓慢加液，有助于防止HEK细胞脱落。将细胞置于37 °C、5% CO₂培养箱中过夜培养。₂ 培养箱
   8. 用10 mL注射器收集病毒上清液，将上清液吸入注射器中，连接0.45 µm注射式滤器，将病毒上清液推入新的收集管中。约16 h后进行第一次病毒上清液收集。
2. 纤连蛋白病毒浓缩与转导
   1. 向未经处理的6孔培养板中加入2 mL含0.1 mg重组人纤连蛋白片段的1×PBS溶液。根据细胞数量和基因型准备所需量的纤连蛋白。每孔足以转导1000万c-Kit+细胞。4 °C条件下孵育过夜。
   2. 第二天，用移液器从孔中移除纤连蛋白，每孔加入2 mL含2% BSA的无菌1×PBS以封闭孔板，在室温下孵育30分钟。通过真空泵吸除BSA溶液，再用移液器加入2 mL 1×PBS充分洗涤，随后通过真空泵吸除PBS。
   3. 立即加入新收集并过滤（0.45 µm）的病毒上清液，体积不超过5 mL。在435 x g 在32 °C下孵育2小时。去除上清液 通过 抽真空，加入更多新收集的病毒上清液，重复此步骤，再次离心。移除上清液 通过 抽真空，并加入2 mL 1×PBS洗涤孔板，随后吸除液体 通过 真空
   4. 将经培养过夜的c-Kit+小鼠细胞离心后弃去上清，用完全IMDM培养基重悬细胞沉淀，继续培养。将这些细胞在2 x 10⁶ 细胞/1 mL 细胞 IMDM 完全培养基，置于 37 °C、5% CO₂ 的培养箱中培养₂) 将细胞悬液充分混匀后，移液至已包被病毒的纤维连接蛋白孔板中。在1,200 x g 在25 °C下孵育90分钟。将细胞置于37 °C、5% CO2的培养箱中。
   5. 转导后48小时，以1,200 x g离心收集细胞沉淀。 g 4 °C 下离心 5 分钟，弃上清，用 FACS 缓冲液 #1（1x PBS + 0.5% BSA）重悬细胞，调整细胞浓度至 6 x 10⁶⁶/mL。通过流式细胞术检测YFP阳性细胞百分比，确定BCR-ABL1阳性细胞的比例。
   6. 使用标准程序采集事件。首先，根据前向散射和侧向散射对活细胞设门。然后，基于阴性对照排除YFP阴性细胞，对YFP阳性活细胞设门。 （图1）

结果

图1：FACS结果显示移植小鼠与野生型小鼠（阴性对照）血液中YFP+细胞的频率。 上图显示细胞的散点图及设门策略。下图显示YFP与侧向散射光的直方图。MFI大于>10³的细胞被定义为YFP阳性细胞。骨髓细胞转导后计算转导效率时也采用类似的设门方法。请点击此处查看该图的放大版本。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
DMEM	Cellgro (corning)	15-013-CV
重组人纤连蛋白片段 RetroNectin	Takara	T100B
FBS	Atlanta biological	S11150
青霉素-链霉素溶液（Penn/Strep）	Cellgro (corning)	30-002-CI
L-谷氨酰胺	Cellgro (corning)	25-005-CL	5 mg/mL 水溶液储备液
HEPES	Sigma	H7006
PBS	Corning	21040CV
Na2HPO4·7H2O	Sigma	S9390
氯化钙	Invitrogen	K278001
2× HBS	Invitrogen	K278002
EDTA	Ambion	AM9261
BSA	Sigma	A7906
人长期培养起始细胞检测试剂盒	Stem Cell Technologies
TC-10 自动细胞计数仪	Bio-RAD
ROSACreERT2/c-Fos fl/fl Dusp1-/-	本实验室制备
ROSACreERT2/c-Fosfl/fl	本实验室制备
ROSACreERT2	Jackson Laboratory
C57Bl/6	Jackson Laboratory
CML-CD34+ 细胞和正常 CD34+ 细胞	辛辛那提大学医院
LSR II（流式细胞分析仪）	BD
Fortessa I（流式细胞分析仪）	BD
FACSAriaII（流式细胞分选仪）	BD
NAPCO 8000 WJ 系列 CO2 培养箱	Thermo scientific
Swing bucket rotor 离心机 5810R	Eppendorf
1/2 cc Lo-Dose u-100 胰岛素注射器 28 G1/2	Becton Dickinson	Becton Dickinson
氢化可的松琥珀酸钠	Stem Cell Technologies	7904
GM-CSF	Prospec	CYT-221
G-SCF	Prospec	CYT-220
人 IL-3	Prospec	CYT-210
人 SCF	Prospec	CYT-255
促红细胞生成素	Amgen	5513-267-10
BD Perm/Wash（磷酸化流式检测用透化与洗涤液）	BD	554723
BD Cytofix/Cytoperm（固定与透化溶液）	BD	554714
BD Pharm Lyse	BD	555899
70 μm 尼龙细胞滤网	Becton Dickinson	352350
0.45 μm 一次性滤器	PALL	2016-10