基于甲基纤维素的集落形成单位检测：一种评估抗癌化合物对白血病细胞集落形成影响的方法

摘要

来源：Kesarwani, M.，等。评估 c-Fos 和 Dusp1 在癌基因依赖性中作用的方法。J. Vis. Exp. (2019)。

本视频介绍了基于甲基纤维素的集落形成单位（CFU）实验方案，该方法可用于鉴定和计数白血病细胞在接受抗癌化合物处理后所形成的集落数量。

方案

1. 菌落形成单位实验

1. 将含细胞因子的甲基纤维素在室温下解冻1–2小时。使用5 mL无针头注射器，将3 mL甲基纤维素分装至FACS管中。在细胞分选仪上分选YFP阳性细胞。
2. 离心细胞，将沉淀重悬于IMDM完全培养基中。计数待铺板的细胞，并稀释至每100 µL完全IMDM培养基中含有5,000个YFP阳性细胞。
3. 将含有5,000个YFP阳性细胞的100 µL细胞悬液及相应的抑制剂加入3 mL甲基纤维素中。高速涡旋10–30秒以充分混匀。
4. 待大部分气泡逸出后，使用1 mL注射器将1 mL培养基分装至三个重复的3 cm培养皿中：将培养基沿培养皿一侧排出，然后缓慢旋转倾斜培养皿，使液体均匀铺展。
5. 所用抑制剂的终浓度分别为：伊马替尼（imatinib）3 µM、DFC 0.2 µM、BCI 0.5 µM，可单独使用或组合使用。如需删除c-Fos，可在甲基纤维素中加入4-羟基他莫昔芬（4-hydroxytamoxifen，1 µg/mL）进行细胞铺板。
6. 铺板后，将培养皿放入一个大号培养皿中，中央放置一个含有2 mL无菌水的开放小皿以维持湿度。盖上大号培养皿，于37 °C、5% CO₂ 培养箱中小心孵育。铺板一周后，在显微镜下计数菌落总数并记录。
7. 选取适当培养皿中的部分菌落，通过PCR分析c-Fos的删除情况。用P1000吸头吸取菌落，通过多次冲洗吸头将细胞释放到500 µL 1×PBS中。将细胞悬液在6,000 × g 离心1分钟，然后使用基因组DNA提取试剂盒从细胞沉淀中提取DNA。
8. 使用引物mFos-FP3和mFos-RP5对提取的基因组DNA进行PCR扩增。在2%琼脂糖凝胶上分析PCR产物，并使用凝胶成像系统拍照记录。
9. 为直观展示菌落形态，可使用碘硝基四氮唑蓝（Iodonitrotetrazolium chloride）对菌落进行染色。将10 mg碘硝基四氮唑蓝溶于10 mL水中，配制成1 mg/mL的溶液。在超净台内无菌操作，使用连接0.2 µm滤器的Luer锁注射器对溶液进行过滤除菌。
10. 在超净台内，将100 µL染色液沿CFU培养皿边缘逐滴加入，注意避免滑动或扰动菌落。将培养皿置于37 °C、5% CO₂ 细胞培养箱中过夜孵育。菌落将变为深红褐色。在无菌超净台内使用白色背景，对染色后的CFU培养皿进行拍照。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
IMDM	Cellgro（康宁）	15-016-CVR
甲基纤维素小鼠集落形成单位培养基 MethoCult GF M3434	干细胞	3434
4-羟基他莫昔芬	Sigma	H6278
重组小鼠 SCF	Prospec	CYT-275
重组小鼠 Flt3-配体	Prospec	CYT-340
重组小鼠 IL-6	Prospec	CYT-350
重组小鼠IL-7	Peprotech	217-17
DFC	LKT Laboratories Inc.	D3420
脑机接口	Chemzon Scientific	NZ-06-195
伊马替尼	LC 实验室	I-5508
1× PBS	Cellgro（康宁）	21-040-CV
1/2 cc 低剂量u-100胰岛素注射器，28 G1/2	Becton Dickinson	329461
碘硝基四唑氯化物	Sigma	I10406
<强>仪器
NAPCO 系列 8000 WJ CO2 培养箱	赛默飞世尔科技
水平转子离心机 5810R	Eppendorf
C-1000 梯度PCR仪	伯乐（Bio-RAD）
ChemiDoc 成像系统（用于凝胶和蛋白质印迹的成像系统）	伯乐（Bio-RAD）	17001401
<强>小鼠
ROSACreERT2	杰克逊实验室
ROSACreERT2/c-Fos fl/fl Dusp1-/-	自制
ROSACreERT2/c-Fosfl/fl	自制