细胞外嘌呤代谢：基于高效液相色谱法检测白血病细胞中腺苷生成与代谢的实验方法

摘要

来源：Serra S 等。基于高效液相色谱法的检测方法用于监测人慢性淋巴细胞白血病细胞中外源性核苷酸/核苷的代谢。J. Vis. Exp. (2016)

本视频介绍了一种定量反相高效液相色谱法（RP-HPLC），用于检测白血病癌细胞在细胞外环境中消耗AMP所产生的腺苷及相关嘌呤的代谢情况。该方案描述了一种灵敏、特异、可靠且可重复的反相高效液相色谱（RP-HPLC）检测方法，该方法已针对纯化的慢性淋巴细胞白血病（CLL）细胞在不同培养条件下产生的细胞外嘌呤核苷酸和核苷的定量分析进行了开发和验证。

方案

1. 标准品和抑制剂储备液的配制

1. 配制AMP溶液时，称取0.00345 g AMP，溶于5 ml无血清培养基中，配制成2 mM的AMP标准溶液。
2. 配制ADO：称取0.00265 g ADO，溶于5 ml无血清培养基中，配制成2 mM的ADO标准溶液。
3. 配制肌苷溶液时，称取 0.00268 g 肌苷（INO），溶于 5 ml 无血清培养基中，配制成 2 mM 的肌苷标准溶液。
4. 配制400 µ将1 ml的2 mM储备液与4 ml无血清培养基混合，配制成AMP、ADO和INO的5 ml终体积M溶液。
   1. 将每种400进行1:4稀释 µM 标准溶液以获得 100 µM 浓度，通过移液加入 500 µ400升 µ1,500 中的 M 溶液 µ无血清培养基（最终体积 2 ml）。
   2. 在无血清培养基中对每种化合物进行系列稀释，以获得以下浓度：100 µM - 50 µM - 25 µM - 10 µM - 5 µM - 2.5 µM - 1 µM - 0.5 µM - 0.25 µM.
      注意：例如，用移液器吸取 1 ml 的 100 µ在1 ml无血清培养基中将M溶液按1:2比例稀释，以获得50 µM 浓度，并继续进行后续稀释。
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结果

图1. 内标标准曲线的建立。 ADO的代表性校准标准曲线及所得相对方程。 请点击此处查看该图的放大版本。

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材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
AIM V 无血清培养基 	GIBCO 	12055-091 	液体（研究级）
腺苷 5’-单磷酸（AMP） 	Sigma-Aldrich 	A1752
腺苷（ADO）	Sigma-Aldrich 	A9251
肌苷（INO） 	Sigma-Aldrich 	I4125
乙腈（CHROMASOLV Plus） 	Sigma-Aldrich 	34998	HPLC 级
乙酸铵 	Sigma-Aldrich 	9688	7 mM，pH 3.0
短螺纹小瓶 	VWR 	548-0029 	1.5 ml/玻璃
微量插件 	VWR	 548-0006 	0.1 ml/玻璃
螺纹盖 	VWR 	548-0085 	9 mm/聚丙烯蓝色
Atlantis dC18 色谱柱 	Waters 	186001344	5 µm，4.6 mm × 150 mm
Atlantis dC18 保护柱 	Waters 	186001323	5 µm，4.6 mm × 20 mm
Waters Alliance 2965 分离模块 	Waters 		HPLC 分离模块
Waters 2998 光电二极管阵列（PDA）检测器 	Waters 		紫外检测器
Waters Empower2 软件 	Waters