细胞外嘌呤代谢：基于高效液相色谱法检测白血病细胞中腺苷生成与代谢的实验方法

摘要

来源：Serra S 等。基于高效液相色谱法的检测方法用于监测人慢性淋巴细胞白血病细胞中外源性核苷酸/核苷的代谢。J. Vis. Exp. (2016)

本视频介绍了一种定量反相高效液相色谱法（RP-HPLC），用于检测白血病癌细胞在细胞外环境中消耗AMP所产生的腺苷及相关嘌呤的代谢情况。该方案描述了一种灵敏、特异、可靠且可重复的反相高效液相色谱（RP-HPLC）检测方法，该方法已针对纯化的慢性淋巴细胞白血病（CLL）细胞在不同培养条件下产生的细胞外嘌呤核苷酸和核苷的定量分析进行了开发和验证。

方案

1. 标准品和抑制剂储备液的配制

1. 配制AMP溶液时，称取0.00345 g AMP，溶于5 ml无血清培养基中，配制成2 mM的AMP标准溶液。
2. 配制ADO：称取0.00265 g ADO，溶于5 ml无血清培养基中，配制成2 mM的ADO标准溶液。
3. 配制肌苷溶液时，称取 0.00268 g 肌苷（INO），溶于 5 ml 无血清培养基中，配制成 2 mM 的肌苷标准溶液。
4. 配制400 µ将1 ml的2 mM储备液与4 ml无血清培养基混合，配制成AMP、ADO和INO的5 ml终体积M溶液。
   1. 将每种400进行1:4稀释 µM 标准溶液以获得 100 µM 浓度，通过移液加入 500 µ400升 µ1,500 中的 M 溶液 µ无血清培养基（最终体积 2 ml）。
   2. 在无血清培养基中对每种化合物进行系列稀释，以获得以下浓度：100 µM - 50 µM - 25 µM - 10 µM - 5 µM - 2.5 µM - 1 µM - 0.5 µM - 0.25 µM.
      注意：例如，用移液器吸取 1 ml 的 100 µ在1 ml无血清培养基中将M溶液按1:2比例稀释，以获得50 µM 浓度，并继续进行后续稀释。
5. 配制10 mM的APCP PBS溶液作为储备液；分装后于-30 ℃保存 °C.
6. 制备 EHNA 盐酸盐、dCF 和双嘧达莫的 10 mM 储存液，溶剂为二甲基亚砜（DMSO）；分装后于 -30 °C 保存 °C.

2. 编程设定高效液相色谱方法

1. 通过将 0.770 g 乙酸铵溶解于 2 L 双重去离子水中，配制 7 mM 乙酸铵缓冲液（缓冲液 A）。用盐酸调节 pH 至 3.0。
2. 准备一个玻璃瓶，装入至少 2 L 用于高效液相色谱的超纯乙腈（缓冲液 B），并将保护柱和色谱柱连接至高效液相色谱仪。
   注意：使用过程中，色谱柱和缓冲液均处于室温（RT）。
3. 登录高效液相色谱软件，选择 "浏览项目"按钮。进入 "文件"菜单，选择 "新建方法"，然后选择 "仪器方法"。
4. 按照 表 1 编程平衡色谱柱的方法。设定流速为 1.00 ml/min，并设置紫外检测器在 260 nm 处读数。保存仪器方法，再次从“文件”菜单中选择“新建方法”，然后选择“方法集”。选择之前保存的仪器方法，并以相同名称保存当前方法集。
5. 重复步骤 2.3，按照表 2 编程样品运行方法。设定流速为 1.00 mL/min，并设置紫外检测器在 260 nm 处读数。保存仪器方法，并重复步骤 4.4 中所述相同流程，以保存方法集。
6. 选择 "运行样品"按钮，从 "文件"菜单中选择 "新建样品集方法"。
7. 选择 "空白"选项，输入小瓶编号（在自动进样器中）、样品名称和进样体积（50 µl）。在 "方法集"列中选择之前保存的方法集，并输入总运行时间（min）。
   注意：每次样品运行前，在 "方法集"列中输入平衡色谱柱方法（表 1），并输入总运行时间（min）。

3. 每种化合物标准校准曲线的建立

1. 注射 50 µ空白样品（不含腺苷脱氨酶的特定无血清培养基）及各标准样品的处理方法，参见所述方法 表1 和 表2.
   1. 使用平衡柱法（表1每次样品运行前进行，并设置样品运行中所述的梯度条件 表 2 以获得足够的峰分离。参考 表3 在这些高效液相色谱条件下，AMP、ADO 和 INO 的报道保留时间。
   2. 测定不同浓度下 AMP、ADO 和 INO 的峰面积 "过程" HPLC 软件中的按钮，然后 "整合" 选项。或者，手动选择每个峰的起始点和结束点。
   3. 将各标准品的峰面积对名义浓度作图，得到九点校准曲线（100, 50, 25, 10, 5, 2.5, 1, 0.5, 0.25） µM
   4. 计算AMP、ADO和INO的直线方程： y = mx + b,
      其中 x 是 µM 浓度和 y 对应于峰面积。

   时间	流速（ml/min）	%A	%B
   	1.00	100	0
   1.24	1.00	100	0
   6.22	1.00	2	98
   18.65	1.00	2	98

   表1：平衡柱法 色谱柱平衡过程中溶剂变化的示意图。缓冲液A：7 mM乙酸铵，pH 3.0。缓冲液B：乙腈。

   时间	流速（ml/min）	%A	%B
   	1.00	0	100
   3.74	1.00	0	100
   13.71	1.00	15	85
   17.00	1.00	100	0
   20.00	1.00	100	0

   表2：运行样品方法高效液相色谱法测定嘌呤类化合物的溶剂变化示意图。缓冲液A：7 mM乙酸铵，pH 3.0。缓冲液B：乙腈。

   	保留时间	λ最大值
   AMP	8.00 分钟	260
   INO	11.00 分钟	260
   ADO	11.90 分钟	260

   表3：嘌呤类化合物的保留时间 AMP、ADO 和 INO 的典型保留时间。紫外检测器设定在 260 nm 处进行检测。

   4. 抑制剂预处理及与底物（AMP）孵育

   1. 为检测AMP消耗以及在未抑制CD73、ADA和核苷转运蛋白条件下的ADO和INO生成，将纯化的2 x 10⁶细胞重悬于相应反应体系中⁶ CD19⁺/CD5⁺ CLL 细胞在 250 µ无血清培养基，并将细胞接种于48孔板（或1.5 ml微量离心管）中。
   2. 加入250 µ400 毫升 µM AMP 或 AMP 加抑制剂，以获得 200 的终浓度 µM AMP。设置一个不含底物的对照条件，作为空白样品。
   3. 37℃孵育30至60分钟 °C.
   4. 孵育时间结束时，收集500 µ将上清液转移至预冷的微量离心管（置于冰上），立即在4℃条件下以17,000 × g离心 °5 分钟，C
   5. 将上清液转移至新的1.5 ml微量离心管中，并立即于-80℃保存 °C 或进入高效液相色谱运行的样品制备步骤。

   5. 高效液相色谱样品制备

   1. 将上清液用0.2 μm滤器过滤至新的1.5 ml微量离心管中 µm 注射器滤器。使用 1 ml 注射器进行过滤。
   2. 如果高效液相色谱系统配有自动进样器，请准备用于高效液相色谱的玻璃小瓶，并在样品体积较小时使用0.1 ml的微型插入管。
   3. 转移至少100 µ用微量移液器或玻璃巴斯德移液器将样品转移至玻璃小瓶中。注意避免产生气泡，并用螺旋盖密封小瓶。
   4. 样品现已准备好用于反相高效液相色谱分析。

   6. 嘌呤的高效液相色谱检测

   1. 选择 "运行样品" 按钮；选择 "新样本集方法" 从 "文件" 菜单
   2. 选择 "空" 选项并注明：进样瓶编号（在自动进样器中）、样品名称、进样体积（50 µl）。
   3. 选择文中所述的平衡柱方法和运行样品方法 表1 和 表2分别用于后续所有空白和样品运行。
      注意： 设置平衡柱方法（表1每次运行样品前。
   4. 注射 50 µ空白（无血清培养基）及各样品的体积
   5. 测定每个样品中嘌呤的浓度，通过获取AMP、ADO和INO在所述保留时间处的峰面积进行定量。 表3.
      1. 选择 "过程" 按钮，然后下一步 "整合" 可选方法。也可手动选择每个单峰的起始点和终止点以获取峰面积测量值。操作方式为在峰的起始点与终止点之间绘制一条连线。
      2. 确定 µM 浓度，应用标准曲线所得方程计算： y = mx + b，其中 x 代表 µM 浓度和 y 是从未知样品中测得的峰面积。
         ​注意： ADO校准标准曲线的一个示例如下所示 图1，其中： x = (y 区域 - 981.02) / 40026
   6. 考虑到 2 x 10⁶ 细胞用 0.500 ml 培养基重悬，计算 µAMP、ADO 和 INO 消耗和/或产生的摩尔数由 10⁶ CLL 细胞，采用以下比例：
      µ摩尔数：1,000 毫升 = x µ摩尔数：0.250 ml
      注意： 的 µ1,000 ml 中的摩尔数（数量 µ1升中的摩尔数（mol/L）相当于 µM 浓度和 x 是 µ由10产生的核苷酸或核苷的摩尔数⁶ 细胞。最后，转换 µ将摩尔转换为10纳米摩尔消耗和/或生成量⁶ CLL 细胞：纳摩尔数 = µ摩尔 × 1,000

结果

图1. 内标标准曲线的建立。 ADO的代表性校准标准曲线及所得相对方程。 请点击此处查看该图的放大版本。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
AIM V 无血清培养基 	GIBCO 	12055-091 	液体（研究级）
腺苷 5’-单磷酸（AMP） 	Sigma-Aldrich 	A1752
腺苷（ADO）	Sigma-Aldrich 	A9251
肌苷（INO） 	Sigma-Aldrich 	I4125
乙腈（CHROMASOLV Plus） 	Sigma-Aldrich 	34998	HPLC 级
乙酸铵 	Sigma-Aldrich 	9688	7 mM，pH 3.0
短螺纹小瓶 	VWR 	548-0029 	1.5 ml/玻璃
微量插件 	VWR	 548-0006 	0.1 ml/玻璃
螺纹盖 	VWR 	548-0085 	9 mm/聚丙烯蓝色
Atlantis dC18 色谱柱 	Waters 	186001344	5 µm，4.6 mm × 150 mm
Atlantis dC18 保护柱 	Waters 	186001323	5 µm，4.6 mm × 20 mm
Waters Alliance 2965 分离模块 	Waters 		HPLC 分离模块
Waters 2998 光电二极管阵列（PDA）检测器 	Waters 		紫外检测器
Waters Empower2 软件 	Waters