荧光标记的T-ALL细胞分离：一种从成年斑马鱼中分离T-ALL细胞的方法

摘要

来源：Pruitt, M. M., 等 在斑马鱼Myc诱导的T细胞急性淋巴细胞白血病中分离侧群细胞。J. Vis. Exp. (2017)。

本方案描述了从成年斑马鱼中分离荧光标记的T细胞急性淋巴细胞白血病（T-ALL）肿瘤细胞，并利用台盼蓝染料对其进行定量的技术。

方案

1. 从原发性肿瘤鱼中收集荧光标记的T-ALL细胞

1. 准备至少 20 mL 的 10% 热灭活胎牛血清，溶于 0.9x 磷酸盐缓冲液（FBS/PBS）中。
2. 向一瓶肝素钠盐（300 单位）中加入 1 mL FBS/PBS。
3. 选择肿瘤面积超过体表 50% 的鱼，或摄食或游动困难的鱼。通过过量三卡因麻醉或冰水浸泡法处死鱼类。通过观察鳃部运动和心跳停止来确认死亡。
4. 使用刀片切除鱼头。
5. 用肝素溶液冲洗鱼体腔，以去除多余的红细胞。
   1. 使用移液器，向鱼体腔内注入 100 µL 肝素溶液（将 1 mL FBS/PBS 加入一瓶肝素钠盐中）。吸出所有溢出液体（其中含有血细胞），并将其转移至 1.5 mL 微量离心管中。
   2. 使用新的移液器吸头再次冲洗体腔。至少重复冲洗三次，或直至溢出液体中无可见血液为止。
   3. 丢弃本步骤中所有冲洗液，因其不会用于后续分析。
6. 收集白血病细胞。
   1. 向鱼体腔内注入 100 µL FBS/PBS。
   2. 用移液器吸头轻轻按压鱼体外部，挤出肿瘤细胞。
      注意： 若在解剖显微镜下操作此步骤，可清晰观察到肿瘤细胞从体腔中流出。
   3. 将每次冲洗所得液体和细胞收集至同一 1.5 mL 微量离心....

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
同源型斑马鱼（CG2）			参见 Mizgireuv 等，2006
rag2:c-myc 质粒			Langenau 实验室
de Jong 实验室构建的 rag2:GFP 质粒			来自 Langenau 实验室的 rag2 启动子
pCS2-transposase 质粒			Chien 实验室
SteREO Discovery V8 显微镜	Carl Zeiss Microscopy	495015-0008-000
三卡因甲磺酸盐（MS-222）	Western Chemical, Inc	Fisher Scientific - NC0342409	100 g
胎牛血清（FBS）	HyClone Laboratories, Inc.	Fisher Scientific - SH3007103	500 mL
磷酸盐缓冲液（PBS）	Gibco by Life Technologies	1001-023	pH 7.4 (1x) - 500 mL
肝素钠盐	Sigma-Aldrich	2106	15 - 300 单位小瓶
40 µm 网格滤器	Falcon Corning Brand	352340	每箱 50 个
台盼蓝	Sigma Life Science	T8154	20 mL - 溶液 (0.4%)