侧群细胞检测：一种从斑马鱼中分离肿瘤细胞侧群的方法

摘要

来源：Pruitt, M. M., 等。在斑马鱼Myc诱导的T细胞急性淋巴细胞白血病中分离侧群细胞。J. Vis. Exp. (2017)。

以下方案描述了一种从成年斑马鱼中分离T细胞急性淋巴细胞白血病（T-ALL）肿瘤细胞中侧群细胞（即干细胞）的方法。由于侧群细胞缺乏明显的细胞标志物，因此我们采用Hoechst 33342染料外排实验对其进行分离。

方案

1. 使用 Hoechst 33342 染色荧光标记的 T-ALL 细胞以鉴定侧群细胞

1. 用无核酸酶的 H₂O 将 Hoechst 33342 按 1:10 稀释，配制成 1 mg/mL 的工作液。将染料储存于 4 °C 并避光保存。
2. 将 49.1 mg 维拉帕米溶解于 1 mL 二甲基亚砜（DMSO）中，配制成 100 mM 的溶液。
   注意：维拉帕米是 ABC 转运蛋白的抑制剂，是侧群细胞实验中的重要对照。将维拉帕米加入样本中可抑制 ABC 转运蛋白外排 Hoechst 33342 染料的能力。因此，真正的侧群细胞在加入维拉帕米后会消失。
3. 将水浴锅预热至 28 °C。
4. 在避光条件下向荧光激活细胞分选（FACS）管中加入细胞和溶液，制备样本和对照组。
   1. 向 FACS 管中加入 10⁶ 个细胞、15 µL 的 1 mg/mL Hoechst 33342 溶液和 2.5 µL DMSO 来制备样本。用 FBS/PBS 调整体积至 1 mL。
   2. 向 FACS 管中加入 10⁶ 个细胞、15 µL 的 1 mg/mL Hoechst 33342 溶液和 2.5 µL 的 100 mM 维拉帕米溶液来制备对照组。用 FBS/PBS 调整体积至 1 mL。
      注意：建议每样本至少使用 10⁶ 个细胞，但更推荐使用更多细胞，尤其是当侧群细胞需分选用于后续分析时。细胞密度不得超过 10⁶ 个细胞/mL，并维持 Hoechst 33342 的终浓度为 15 µg/mL。若染色 10 × 10⁶ 个细胞，则总反应体积为 10 mL。
5. 在 28 °C 水浴中避光孵育 120 分钟。
6. 孵育结束后立即将细胞置于冰上，并保持避光。
7. 在 4 °C、300 × g 条件下离心 6 分钟，沉淀细胞。弃去上清液，用 1 mL FBS/PBS 洗涤一次。
8. 在 4 °C、300 × g 条件下再次离心 6 分钟，弃去上清液，将细胞重悬于 1 mL FBS/PBS 中。
9. 保持在 4 °C 直至进行细胞分选。
10. 在细胞分选前 15 分钟，向每 1 mL FBS/PBS 中加入 2 µL 碘化丙啶（PI）储备液（1 mg/mL）（终浓度：2 µg/mL）。充分混匀。

2. 使用流式细胞术在荧光标记的T细胞急性淋巴细胞白血病细胞群中鉴定侧群细胞

1. 使用配备紫外激光用于Hoechst 33342染料激发、488 nm激光用于PI激发以及GFP+ T-ALL细胞检测的细胞分选仪，分析经染色的斑马鱼T-ALL细胞悬液。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
胎牛血清（FBS）	HyClone Laboratories, Inc.	Fisher Scientific - SH3007103	500 mL
磷酸盐缓冲液（PBS）	Gibco by Life Technologies	1001-023	pH 7.4 (1x) - 500 mL
Hoechst 33342	Life Technologies	H3570	10 mL
维拉帕米（Verapamil）	Sigma Life Science	V4629	1 g
二甲基亚砜（DMSO）	Sigma Life Science	D8418	100 mL
碘化丙啶（Propidium Iodide）	Life Technologies	P3566	10 mL
FACSAria Fusion 细胞分选仪	BD Biosciences