移植胰岛:一种将胰岛植入小鼠眼前房进行体内成像的方法

所有涉及动物模型的程序均已由当地机构动物护理委员会和 Jove 兽医审查委员会审查

1. 移植设备和手术台的准备

注意:所有手术工具都应进行高压灭菌，手术台和器械应用 70% 酒精消毒。

1. 通过鼻罩将立体定位头架连接到麻醉装置，然后打开加热垫。
2. 将气密 Hamilton 注射器连接到聚乙烯管和钝端眼套管。
   注意:建议在组装前用 PBS 填充所有部件。检查是否有残留的气泡，如果存在，请将其清除。
3. 将 Hamilton 注射器紧紧地连接到桌子上（图 1a）或可移动底座（图 1e），并将管子连接到立体显微镜上，套管垂下（即等待位置><）。 注意:使用手术胶带，因为它很容易去除和重新连接。
4. 准备一个 1 mL 注射器，连接到一个装满 0.1 mg/kg 丁丙诺啡溶液的 30 G 针头。
5. 准备装有无菌 PBS 的注射器。或者，使用移液器。
6. 留出一个带有加热灯的干净唤醒笼。

2. 手术受体小鼠的麻醉和定位

>注意:所有动物均在隆德大学的动物设施中饲养和饲养。

1. 在充满 40% O₂/60% N₂/3% 异氟醚的腔室中麻醉小鼠，并将麻醉的小鼠转移到温暖加热垫上的头架平台上（图 1a）。检查踏板反射是否缺失。
   注意:异氟醚麻醉是术后快速恢复的首选麻醉方法。显微镜室必须通风良好才能使用异氟醚。
2. 将小鼠的鼻子放入连接到 40% O₂ /60% N₂ 0.9%–1.5% 异氟醚麻醉机的麻醉面罩中。用拇指和手指将头部稍微抬起，并使用侧面的金属片将其固定。确保听筒将头部固定在耳朵正下方。将 0.1 mg/kg 丁丙诺啡溶液皮下注射到小鼠背部。
   注意: 丁丙诺啡用作镇痛药。
3. 倾斜头部，使要手术的眼睛朝上并靠近研究人员。
4. 用钝钳轻轻缩回要移植的眼睑，将眼睛弹出，然后用镊子松散地固定。确保镊子的尖端被连接到头架平台的聚乙烯管覆盖（图 1a，插图）。
5. 始终将无菌 PBS 滴在眼睛上，保持双眼湿润。
6. 将人胰岛从密封的 1.5 mL 管（第 1 部分）转移到装有无菌 PBS 的培养皿中，并确保胰岛彼此靠近，以尽量减少转移的细胞培养基量（图 1c）。
7. 在通过聚乙烯管连接到 Hamilton 注射器的眼套管中拾取 ~20-30 个胰岛。
   注意: 尽可能少地吸收胰岛的液体。
8. 将管子倒挂并连接到立体显微镜（图 1d）。小心地用胶带粘住管子，让胰岛沉到管子的末端，朝向套管。

3. 移植手术

注意:这种方法之前已经描述过用于小鼠胰岛的移植。本文介绍了一个略微修改的程序。

1. 捏住后腿上的垫子，确保鼠标处于睡眠状态。
2. 在不中断血流的情况下拧紧限制眼睛的镊子，并将无菌 PBS 液滴滴在眼睛上。
3. 使用 25 G 针头作为手术刀，向上斜切，小心地仅穿透角膜尖端的一半，并做一个横向切口。将孔向上倾斜;移植后孔将更容易密封（图 1f）。
4. 小心地提起角膜，让预装胰岛的套管进入眼睛，然后慢慢地将胰岛涂抹在眼睛中。避免将套管插入前房以防止虹膜损伤，而是小心地推向角膜开口（图 1g）。慢慢从 ACE.
   中缩回套管 注意:目标进样体积为 3-8 μL。如果体积太大，它会使眼睛暴露在不必要的高眼压下，并可能导致注射的胰岛从前房反流。
5. 当由于眼腔压力增加而难以插入胰岛时，通过加强侧切口部位来扩大切口部位并重新涂抹胰岛><。 注意:有时，引入的气泡可以用作空间支架。
6. 将眼胶涂在眼睛上，松开束缚眼睛的镊子，将鼠标放在异氟醚上 8-10 分钟，让胰岛凝固。
7. 取下固定眼睑的镊子，将眼睑放回正常位置。
8. 从头部支架上取下鼠标，并将其转移到唤醒笼中。
9. 当鼠标醒来并移动时，将其转移回原来的笼子中，并保存在动物笼中直到扫描（建议至少 5 天）。

图 1:胰岛移植到眼睛的前房。
（a） 移植装置显示麻醉小鼠固定在立体定位头架中，暴露的眼睛（插图）位于固定在桌子上的准备好的汉密尔顿注射器旁边，立体显微镜准备挑选小鼠胰岛 （b） 或人胰岛 （c）。（d） 装有胰岛的眼套管的等待位置。（e） 正在进行的移植，以及 （f） 用于用眼套管尖端小心地提起角膜并将胰岛分配到前房 （g） 的单个侧切口的示意图。注射小鼠胰岛 （h） 或人胰岛 （i） 后立即出现的眼睛图像。比例尺 = 500 μm。请单击此处查看此图的较大版本。