胰岛移植：一种将胰岛植入小鼠眼前房用于活体成像的方法

摘要

来源：Nilsson, J.et. al. 活体纵向成像及定量分析人胰岛移植物及其在眼前房中宿主贡献细胞。J. Vis. Exp. (2020)。

本视频介绍了将人胰岛移植到小鼠眼球前房以监测人胰岛移植物再血管化的实验方案 体内它还有助于理解受体细胞与供体细胞在促进移植物包裹和血管化过程中的各自贡献。

方案

所有涉及动物模型的实验程序均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核

1. 移植器械和手术台的准备

注意：所有外科器械应进行高压灭菌，手术台和器械需用70%酒精消毒。

1. 通过鼻罩将立体定位头架连接至麻醉装置，并打开加热垫。
2. 将无菌密封的汉密尔顿注射器连接至聚乙烯管和钝端眼用套管。
   注意：建议在组装前用磷酸盐缓冲液（PBS）充满所有部件。检查是否存在困住的气泡，如有则应清除。
3. 将汉密尔顿注射器牢固地固定在台面（图1a）或可移动底座（图1e）上，并将管路固定于体视显微镜，使套管自然下垂（即待用位置）。
   注意：建议使用手术胶带，因其易于拆卸和重新固定。
4. 准备一支1 mL注射器，连接30 G针头，并吸入0.1 mg/kg的丁丙诺啡溶液。
5. 准备一支含有无菌PBS的注射器，或 alternatively 使用移液器。
6. 准备一个干净的复苏笼，并配备加热灯。

2. 手术受体小鼠的麻醉与体位固定

注意：所有动物均在隆德大学动物实验设施的无病原体环境中繁育和饲养。

1. 将小鼠置于充满40% O₂/60% N₂/3% 异氟烷的麻醉舱中进行麻醉，随后将已麻醉的小鼠转移至加热垫上的头部固定装置平台（图1a）。检查小鼠是否无足底反射。
   注意：异氟烷麻醉是术后快速恢复的首选麻醉方法。使用异氟烷时，显微镜室必须具备良好的通风条件。
2. 将小鼠鼻部放入连接至40% O₂/60% N₂、0.9%–1.5% 异氟烷麻醉机的麻醉面罩中。用拇指和手指轻轻抬起小鼠头部，并使用两侧的金属部件将其固定。确保耳棒将头部固定在耳下方正中位置。在小鼠背部皮下注射0.1 mg/kg 的丁丙诺啡溶液。
   注意：丁丙诺啡用作镇痛剂。
3. 调整头部倾斜角度，使待手术的眼睛朝上并靠近研究人员。
4. 使用钝头镊子轻轻拉开待移植眼的眼睑，将眼球轻柔推出，并用一对镊子松散固定。确保镊子尖端套有连接在头部固定装置平台上的聚乙烯管（图1a，插图）。
5. 始终通过在眼球表面滴加无菌PBS液滴，保持双眼湿润。
6. 将人胰岛从密封的1.5 mL离心管（第1节）转移至含有无菌PBS的培养皿中，并确保胰岛彼此靠近，以尽量减少随胰岛转移的细胞培养基量（图1c）。
7. 用连接聚乙烯管路至哈密尔顿注射器的眼部套管吸取约20–30个胰岛。
   注意：吸取胰岛时应尽可能减少液体量。
8. 将管路倒挂并连接至体视显微镜（图1d）。小心用胶带固定管路，使胰岛沉降至管路末端并靠近套管。

3. 移植手术步骤

注意： 此方法此前已描述用于小鼠胰岛的移植，此处介绍的是稍作修改的实验步骤。

1. 捏住小鼠后肢的足垫，确认小鼠已处于睡眠状态。
2. 收紧固定眼球的镊子，注意不要影响血液流动，并在眼球表面滴加一滴无菌 PBS。
3. 使用25 G针头作为手术刀，针尖斜面向上，小心地仅将针头前端一半刺入角膜，做一次侧向切口。切口方向应略向上倾斜；移植后切口更易闭合（图1f）。
4. 用预装胰岛的套管针轻轻抬起角膜，并缓慢将胰岛注入眼内。避免将套管针插入前房，以防损伤虹膜，而应小心地紧贴角膜切口推入（图1g）。随后缓慢从前房取出套管针。
   注意：注射体积应控制在3–8 µL。若体积过大，会导致眼内压过高，可能引起胰岛从前房反流。
5. 若因眼内压力升高导致胰岛注入困难，可通过扩大侧向切口位置来改善，并重新注入胰岛。
   注意：必要时可引入微小气泡作为占位空间。
6. 在眼球表面涂抹眼用凝胶，松开固定眼球的镊子，并让小鼠保持在异氟烷麻醉状态下静置8–10分钟，使胰岛稳定。
7. 移除夹住眼睑的镊子，将眼睑复位至正常位置。
8. 将小鼠从头部固定装置中取出，并转移至苏醒笼中。
9. 待小鼠清醒并能自主活动后，将其转移回原饲养笼，继续在动物饲养环境中饲养，直至成像检测（建议至少饲养5天）。

结果

图1： 将胰岛移植至眼前房。
(a) 移植装置示意图，显示麻醉后的小鼠固定于立体定位头架上，暴露的眼睛（插图）位于已准备好的Hamilton注射器旁，注射器固定于实验台，体视显微镜就位，可用于拾取小鼠胰岛（b）或人胰岛（c）。(d) 装有胰岛的眼科套管处于等待位置。(e) 正在进行移植操作，(f) 示意图显示通过单侧切口，使用眼科套管尖端小心掀起角膜，并将胰岛释放至眼前房（g）。注射小鼠胰岛（h）或人胰岛（i）后立即拍摄的眼部图像。比例尺 = 500 µm。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
清洁工作台外套
加热垫			设定为 37 °C
Ivis Lumina ll 生物发光成像仪	Caliper		其他可选的生物发光成像系统包括&nbsp;<em>In vivo</em>&nbsp;F PRO（Carestream）和 Photon Imager（Biospace Lab）
解剖剪刀
持针钳（带齿）
针持
27 G 0.3 ml 胰岛素注射器	Terumo	T35525M2913