类器官电穿孔：一种将质粒DNA转染入胃肠道类器官的方法

摘要

来源：Gaebler, A. M.等。胃肠道类器官基因工程的通用高效电穿孔方案。J. Vis. Exp. (2020)。

本视频介绍了将大质粒转染到三维胃肠道类器官中的电穿孔实验方案，以验证其在不同实体中的通用功能，包括胰腺导管腺癌（PDAC）、结直肠癌（CRC）、胆管癌（CCC）和胃癌（GC）类器官。

方案

1. 电穿孔前类器官培养与准备

1. 按照先前所述方法通过组织消化建立类器官，并使用相应的实体特异性培养基在基底膜基质中扩增类器官，详见 表1 及材料表
   注意： 对于人体组织样本，必须获得知情同意，并经伦理委员会批准研究。
2. 将48孔板预热至37 °C，用于电转染后接种。
3. 准备不含抗生素的基础培养基以及不含抗生素的实体特异性类器官培养基（见 表1），并添加10 µM Y-27632 和 3 µM CHIR99021。
   注意： 去除抗生素有助于减少毒性作用；Y-27632 和 CHIR99021 可改善细胞恢复。
4. 类器官的制备（见 图1）
   1. 每份电转染样品，在48孔板中培养5个孔的类器官，使用类器官培养基。
      注意： 应使用处于增殖状态的类器官（通常在上次传代后约2-3天）。
   2. 为每个孔准备含10 µM Y-27632 的230 µL 解离试剂（见 材料表）。
   3. 吸除各孔中的培养基，将类器官在230 µL 预制的解离混合液中进行机械解离。将每份电转染样品对应的5个孔的细胞合并至一个15 m....

结果

图1：电穿孔准备流程。 首先，类器官应解离为包含10–15个细胞的细胞团，并去除抗生素。电穿孔后需将白色泡沫状物质解离。细胞在室温下恢复40分钟后即可接种。请点击此处查看该图的放大版本。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
[Leu15] 胃泌素	Sigma-Aldrich	G9145
A83-01	Tocris Bioscience	2939
高级 DMEM/F-12	Invitrogen	12634010
B27	Invitrogen	17504044
B27 补充剂，不含维生素 A	Thermo Fisher Scientific	12587010
CHIR99021	Stemgent	04-2004
胶原酶 II	Life Technologies	17101-015
胶原酶 XI	Sigma-Aldrich	C9407-100MG
胶原酶 D	Roche	11088866001
Dispase II	Roche	4942078001
DNase I	Sigma-Aldrich	D5319
D-山梨醇	Roth	6213.1
二硫苏糖醇	Thermo Scientific	1859330
EDTA	Roth	8040
福斯科林	Tocris Bioscience	1099
Glutamax	Life Technologies	35050061
Hepes	Thermo Fisher Scientific	15630106
人FGF-10	Preprotech	100-26
KCl	Sigma-Aldrich	P9541
KH2PO4	Roth	3904.2
Matrigel	Corning	356231	基底膜基质
小鼠EGF	Invitrogen	PMG8043
N2	Invitrogen	17502048
NaCl	Roth	3957.1
Na2HPO4	Roth	K300.2
N-乙酰-L-半胱氨酸	Sigma-Aldrich	A9165
烟酰胺	Sigma-Aldrich	N0636
Noggin	n.a.	n.a.	由HEK293细胞产生的条件培养基（Hek293-mNoggin-Fc）
重组人HGF	Preprotech	100-39H
Rspondin	n.a.	n.a.	由HEK293细胞产生的条件培养基（HA-Rspo1-Fc-293T）
SB202190	Sigma-Aldrich	S7067
TrypLE Express	Gibco	12604021	解离试剂
Wnt3A	n.a.	n.a.	由L-Wnt3a细胞产生的条件培养基（来自Sylvia Boj）
Y-27632	Sigma-Aldrich	Y0503
48孔板	Corning	3548
Nepa电穿孔比色皿 2mm间隙带移液管	Nepa Gene Co., Ltd.	EC-002S
电穿孔仪 Nepa21	Nepa Gene Co., Ltd.	n.a.
EVOS FL Auto	Invitrogen	AMAFD1000	荧光显微镜
EndoFree 质粒大提试剂盒	Qiagen	12362
Opti-MEM	Gibco	31985047	电穿孔缓冲液
2 gRNA 串联载体	AddGene	84879
px458 质粒	AddGene	48138	编码sgRNA和Cas9
px458_Conc2 质粒	AddGene	134449	含有两个U6启动子以表达两种不同sgRNA的px458质粒