来源：Gaebler, A. M.等。胃肠道类器官基因工程的通用高效电穿孔方案。J. Vis. Exp. (2020)。
本视频介绍了将大质粒转染到三维胃肠道类器官中的电穿孔实验方案，以验证其在不同实体中的通用功能，包括胰腺导管腺癌（PDAC）、结直肠癌（CRC）、胆管癌（CCC）和胃癌（GC）类器官。
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方法文章
类器官电穿孔：一种将质粒DNA转染入胃肠道类器官的方法
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2023年4月30日
本文内容
摘要
方案
1. 电穿孔前类器官培养与准备
- 按照先前所述方法通过组织消化建立类器官，并使用相应的实体特异性培养基在基底膜基质中扩增类器官，详见 表1 及材料表
注意： 对于人体组织样本，必须获得知情同意，并经伦理委员会批准研究。 - 将48孔板预热至37 °C，用于电转染后接种。
- 准备不含抗生素的基础培养基以及不含抗生素的实体特异性类器官培养基（见 表1），并添加10 µM Y-27632 和 3 µM CHIR99021。
注意： 去除抗生素有助于减少毒性作用；Y-27632 和 CHIR99021 可改善细胞恢复。 - 类器官的制备（见 图1）
- 每份电转染样品，在48孔板中培养5个孔的类器官，使用类器官培养基。
注意： 应使用处于增殖状态的类器官（通常在上次传代后约2-3天）。 - 为每个孔准备含10 µM Y-27632 的230 µL 解离试剂（见 材料表）。
- 吸除各孔中的培养基，将类器官在230 µL 预制的解离混合液中进行机械解离。将每份电转染样品对应的5个孔的细胞合并至一个15 mL 离心管中。
- 涡旋混匀，于37 °C孵育5-15分钟，直至形成含10-15个细胞的细胞团。期间需在显微镜下观察解离情况。加入不含抗生素的基础培养基至10 mL 以终止消化。
注意： 此步骤非常关键！孵育时间过短会降低电转染效率，而过度消化则会降低细胞存活率。 - 在室温下以450 × g 离心5分钟，弃上清，用4 mL 电转染缓冲液（见 材料表）洗涤两次。
- 每份电转染样品，在48孔板中培养5个孔的类器官，使用类器官培养基。
2. 电穿孔
注意：以下方案适用于能够产生方波以及独立的穿孔脉冲和转移脉冲序列的电穿孔仪（参见图2）。可选地，可测量导入样品的阻抗值以及电压、电流和能量，以作为实验可重复性的对照。
- 将类器官沉淀重悬于含有 30 µg 质粒 DNA 的 100 µL 电穿孔缓冲液中（参见材料表）。
注意：所用质粒 DNA 的浓度应超过 5 µg/µL，以确保电穿孔过程中最佳的盐浓度。因此，建议使用内毒素去除型质粒大提试剂盒（参见材料表）制备载体。最多可使用 45 µg DNA，且不会产生细胞毒性效应。 - 将全部 DNA-类器官混合液转移至具有 2 mm 间隙宽度的电穿孔比色杯中，避免产生气泡。
- 设置电穿孔参数（参见表 2、图 2）。
- 用手指轻敲比色杯，轻微混匀细胞，避免起泡。将比色杯放入比色杯室中。
- 按下电穿孔仪的 Ω 按钮，并记录阻抗值。
注意：阻抗值在 30–40 Ω 范围内时效果最佳。通常应保持在 30–55 Ω 之间。若不符合，请检查以下方面：所用比色杯的间隙宽度、电穿孔仪的电缆连接、是否存在气泡、电穿孔混合液的体积及盐浓度是否正确。 - 按下“开始”按钮，启动电穿孔程序，并监控显示的电流、电压和能量数值。
注意：测得的电压、电流和能量值应与设定的电穿孔参数一致。为便于重复实验之间的比较，建议记录这些数据。 - 电穿孔后，立即加入 500 µL 不含抗生素的培养基（含 CHIR99021 和 Y-27632；参见步骤 1.3），通过上下吹打混匀，以解离白色泡沫。
注意：电穿孔后会出现白色泡沫，大量细胞会附着其上，因此充分解离泡沫对防止细胞损失至关重要。 - 使用与电穿孔比色杯配套的移液器将样品完全从比色杯转移至新的 15 mL 离心管中（参见材料表）。建议用基础培养基再次冲洗比色杯，以回收残留细胞。
- 为促进细胞恢复，于室温下孵育 40 分钟。
3. 细胞接种
- 在室温下以 450 × g 离心 5 分钟，弃去上清液。
- 将沉淀重悬于 100 µL 基底膜基质中，并在预热的 48 孔板中接种 20 µL 液滴（参见步骤 1.2）。于 37 °C 培育 10 分钟以促进凝胶聚合，随后加入 250 µL 培养基，培养基中需添加 Y-27632 和 CHIR99021，直至类器官下次传代（约 5–7 天）。
4. 转染效率的测定
注意： 通常建议电穿孔一个携带荧光标记的载体，作为额外的转染对照。根据所选标记及其发色团成熟情况，转染后约24–48小时内可观察到荧光信号18。
- 转染对照组在转染后24-48小时，通过显微镜检查荧光情况 (图3B)
表1：基础培养基、消化混合物和培养培养基的组成。
| 基础培养基成分： | I | II |
| Advanced DMEM/F-12 | - | - |
| Glutamax | 1x | 1x |
| Hepes | 10 mM | 10 mM |
| Penicillin Streptomycin | - | 1x |
| Primocin | 1x | - |
| 通过消化建立 | ||||||||
| 消化液组成： | 结肠 | 胃 | 肝脏 | 胰腺 | ||||
| 正常 | 肿瘤 | 正常 | 肿瘤 | 正常 | 肿瘤 | 正常 | 肿瘤 | |
| Collagenase II | - | - | - | - | - | 0.625 mg/ml | ||
| Collagenase XI | - | 0.1 mg/ml | - | 0.1 mg/ml | - | - | ||
| Collagenase D | - | - | - | - | 2.5 mg/ml | - | ||
| Dispase II | - | 1 mg/ml | - | 1 mg/ml | - | 2.5 mg/ml | ||
| DNase I | - | - | - | - | 0.1 mg/ml | - | ||
| EDTA | 2mM | - | 10mM | - | - | - | ||
| 稀释于 | 螯合缓冲液* | 基础培养基 I | 螯合缓冲液* | 基础培养基 I | 在 EBSS 中 | 基础培养基 I | ||
| 孵育条件： | 冰上 0.5 小时 | 37°C 下 1 小时 | 室温下 0.25–0.5 小时 | 37°C 下 1 小时 | 37°C 下 0.5–1 小时 | 37°C 下 1.5 小时 | 37°C 下 0.5–1 小时 | 37°C 下 2–3 小时 |
| 改编自参考文献： | Sato 等，2011 | Bartfeld 等，2015 | Broutier 等，2016 | Hennig 等，2019 | ||||
| 培养基（基础：基础培养基 II） | |||||
| A83-01 | 0.5 µM | 2 µM | 5 µM | 0.5 µM | |
| B27 | 1x | 1x | 1x | 1x | |
| 不含维生素 A 的 B27 | - | - | 1x | - | |
| 佛司可林 | - | - | 10 µM | - | |
| hFGF-10 | - | 200 ng/ml | 100 ng/ml | 100 ng/ml | |
| hHGF | - | - | 25 ng/ml | - | |
| [Leu15] Gastrin | 10 nM | 1 nM | 10 nM | 10 nM | |
| mEGF | 50 ng/ml | 50 ng/ml | 50 ng/ml | 50 ng/ml | |
| N2 | - | - | 1x | - | 1x |
| N-乙酰-L-半胱氨酸 | 1.25 mM | 1 mM | 1 mM | 1 mM | |
| 烟酰胺 | 10 mM | 10 mM | 10 mM | 10 mM | |
| Noggin | 10 % | 10 % | - | 10 % | |
| Primocin | 1x (100 µg/ml) | 1x (100 µg/ml) | 1x (100 µg/ml) | 1x (100 µg/ml) | |
| 前列腺素 E2 | 10 nM | - | - | - | 1 µM |
| Rspondin | 20 % | 10 % | 10 % | 10 % | |
| SB202190 | 3µM | - | - | - | |
| Wnt3A | 50 % | 50 % | - | 50 % | |
| *螯合缓冲液：蒸馏水中含 5.6 mM Na2HPO4、8.0 mM KH2PO4、96.2 mM NaCl、1.6 mM KCl、43.4 mM 蔗糖、54.9 mM D-甘露醇、0.5 mM DL-二硫苏糖醇 | |||||
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结果
图1：电穿孔准备流程。 首先，类器官应解离为包含10–15个细胞的细胞团，并去除抗生素。电穿孔后需将白色泡沫状物质解离。细胞在室温下恢复40分钟后即可接种。请点击此处查看该图的放大版本。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| [Leu15] 胃泌素 | Sigma-Aldrich | G9145 | |
| A83-01 | Tocris Bioscience | 2939 | |
| 高级 DMEM/F-12 | Invitrogen | 12634010 | |
| B27 | Invitrogen | 17504044 | |
| B27 补充剂，不含维生素 A | Thermo Fisher Scientific | 12587010 | |
| CHIR99021 | Stemgent | 04-2004 | |
| 胶原酶 II | Life Technologies | 17101-015 | |
| 胶原酶 XI | Sigma-Aldrich | C9407-100MG | |
| 胶原酶 D | Roche | 11088866001 | |
| Dispase II | Roche | 4942078001 | |
| DNase I | Sigma-Aldrich | D5319 | |
| D-山梨醇 | Roth | 6213.1 | |
| 二硫苏糖醇 | Thermo Scientific | 1859330 | |
| EDTA | Roth | 8040 | |
| 福斯科林 | Tocris Bioscience | 1099 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050061 | |
| Hepes | Thermo Fisher Scientific | 15630106 | |
| 人FGF-10 | Preprotech | 100-26 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| KH2PO4 | Roth | 3904.2 | |
| Matrigel | Corning | 356231 | 基底膜基质 |
| 小鼠EGF | Invitrogen | PMG8043 | |
| N2 | Invitrogen | 17502048 | |
| NaCl | Roth | 3957.1 | |
| Na2HPO4 | Roth | K300.2 | |
| N-乙酰-L-半胱氨酸 | Sigma-Aldrich | A9165 | |
| 烟酰胺 | Sigma-Aldrich | N0636 | |
| Noggin | n.a. | n.a. | 由HEK293细胞产生的条件培养基（Hek293-mNoggin-Fc） |
| 重组人HGF | Preprotech | 100-39H | |
| Rspondin | n.a. | n.a. | 由HEK293细胞产生的条件培养基（HA-Rspo1-Fc-293T） |
| SB202190 | Sigma-Aldrich | S7067 | |
| TrypLE Express | Gibco | 12604021 | 解离试剂 |
| Wnt3A | n.a. | n.a. | 由L-Wnt3a细胞产生的条件培养基（来自Sylvia Boj） |
| Y-27632 | Sigma-Aldrich | Y0503 | |
| 48孔板 | Corning | 3548 | |
| Nepa电穿孔比色皿 2mm间隙带移液管 | Nepa Gene Co., Ltd. | EC-002S | |
| 电穿孔仪 Nepa21 | Nepa Gene Co., Ltd. | n.a. | |
| EVOS FL Auto | Invitrogen | AMAFD1000 | 荧光显微镜 |
| EndoFree 质粒大提试剂盒 | Qiagen | 12362 | |
| Opti-MEM | Gibco | 31985047 | 电穿孔缓冲液 |
| 2 gRNA 串联载体 | AddGene | 84879 | |
| px458 质粒 | AddGene | 48138 | 编码sgRNA和Cas9 |
| px458_Conc2 质粒 | AddGene | 134449 | 含有两个U6启动子以表达两种不同sgRNA的px458质粒 |
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