胰腺肿瘤中T细胞的离体刺激：一种提高T细胞细胞因子产生的方法

摘要

来源：Spear, S., 等. 原位胰腺肿瘤的生成及肿瘤浸润性T细胞毒性的离体表征. J. Vis. Exp.(2019)。

本文介绍了用于ex vivo T细胞刺激的技术，以提高T细胞内干扰素-γ（interferon-gamma或IFN-gamma）和肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-alpha或TNF-alpha）等细胞因子的胞内浓度。这些细胞因子 可介导有效的抗肿瘤反应，并在肿瘤治疗中发挥治疗作用。 

方案

1. 胰腺肿瘤的消化

1. 将解剖获得的胰腺肿瘤、转移灶肿瘤或正常胰腺组织置于预冷的磷酸盐缓冲液（PBS）中，并置于冰上保存。
   1. 使用镊子将肿瘤转移至培养皿中。
   2. 向50 mL离心管中加入5.0 mL消化液（2 mg/mL胶原酶，0.025 mg/mL DNase RPMI），并置于冰上以防止酶活性提前启动。
      注意：本方案使用V型胶原酶，其活性为≥1单位/mg FALGPA且>125胶原消化单位（CDU）/mg固体。胶原酶和DNase分装后可于-20 °C保存，使用前在冰上解冻。两者完全溶于无菌RPMI培养基后，可通过0.2 µm滤器去除污染物。过滤前必须确保胶原酶完全溶解，以避免材料损失。
   3. 取少量该溶液覆盖培养皿中的肿瘤组织。
   4. 使用无菌手术刀和镊子将肿瘤切成小块，每块长度约小于3 mm。
   5. 用刮刀将肿瘤碎片刮入离心管中，并轻轻颠倒混匀，直至所有组织块均浸没于消化液中。若需批量处理其他肿瘤样本，可暂时置于冰上保存。
   6. 将离心管置于摇床上，在37 °C孵育20分钟。确保所有肿瘤组织块均浸没于液体中，未贴附于管壁边缘。若无法摇动，则每5分钟涡旋震荡一次以促进消化。

2. 从消化后的肿瘤制备单细胞悬液

1. 消化步骤结束后，立即将试管置于冰上以减缓酶活性。
   1. 加入EDTA，使终浓度为20 mM，短暂涡旋混匀。这将进一步减缓酶活性。
   2. 打开管盖，用新鲜的RPMI培养基冲洗管盖内壁，以淋洗下任何肿瘤消化物。
   3. 将一个70 µm细胞筛置于50 mL敞口离心管上，置于冰上（可根据需要调整细胞筛的µm规格）。
   4. 用培养基预润湿滤膜。
   5. 将消化后的细胞重悬，并使用25 mL移液管或更大的移液管冲洗管壁。移液管较宽的开口对于使浓稠的消化液顺利通过至关重要。
   6. 使用25 mL移液管将全部消化液转移至滤筛上。
   7. 使用1 mL注射器活塞在滤膜上方碾磨肿瘤组织。仅进行垂直上下碾磨，以尽量减少对细胞的剪切应力。
   8. 用 RPMI 持续冲洗滤网中的细胞。确保冲洗力度足够以推动细胞通过滤网。
   9. 如果仍有组织需要研磨，但RPMI无法继续滤过，则表明滤网已饱和。此时应将样本转移至新的滤器中，并继续操作。
      注意： 最终，滤膜上仅会留下细胞外基质成分，所有单个细胞均应已通过滤膜。
2. 离心管在300 x g下离心5分钟 g 和 4 °C。
   1. 将细胞沉淀用完全RPMI培养基轻轻重悬，并立即通过另一滤器过滤，以去除无法充分重悬的细胞外基质或大块细胞团。
   2. 此时，若无需刺激处理，可直接跳至以300 x g离心5分钟，随后对分离的细胞进行染色，用于流式细胞术分析。 g 以及 4 °C。将培养板倒置，用力一甩，快速弃去上清液。或者，用冷冻保存液（含 10% DMSO 的 FBS）重悬细胞，于 -80 °C 保存，随后转入液氮中长期保存。
      注意： 冻存步骤可实现免疫细胞在后续时间点的纯化；然而，免疫细胞亚群的定量可能需要优化，以确认细胞数量和表型不受冻融过程的影响。 离体 T细胞刺激最好在新鲜的肿瘤样本上进行。如有需要，此时可通过基于磁珠的死细胞去除或免疫细胞富集检测对样本进行进一步纯化。

3. 细胞准备 离体 刺激

1. 用完全培养基（RPMI 10% FBS，1×青霉素和1×链霉素）将细胞调整至浓度为 2 × 10⁶/100 µL。
   注意： 接种较高数量的总细胞可确保样本中含有足够数量的T细胞用于分析。然而，具体细胞数量可根据样本可获得性及目标T细胞亚群的稀有程度进行相应调整。
   1. 将100 µL细胞悬液加入96孔U型底培养板中。
   2. 加入含有PMA/离子霉素2×工作液的100 µL完全培养基（终浓度分别为0.081 µM和1.34 µM，按生产商推荐浓度），混匀。
      注意： 若需检测脱颗粒/胞吐作用，还需在培养基中加入荧光标记的抗小鼠CD107a抗体。同时必须设置不加CD107a的对照样本。
   3. 将培养板置于37 °C、5% CO₂培养箱中孵育1小时。
   4. 加入20 µL 10×布雷菲德林A（brefeldin A）和莫能菌素（monensin）工作液，使终浓度分别为1.06 µM和2.0 µM（按生产商推荐浓度），混匀。
      注意： 布雷菲德林A和莫能菌素为蛋白质转运抑制剂，可阻断细胞因子等物质向胞外释放，从而使其在细胞内积累，便于流式细胞术检测。若拟通过ELISA或其他类似方法检测上清液中的细胞因子释放，则可省略此步骤。
   5. 将培养板继续置于37 °C、5% CO₂培养箱中孵育4小时。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
70 μm 孔径细胞滤筛	Fisher Scientific	11597522
抗 CD107a PE（克隆号 1D4B）	Biolegend	121612	按 1:100 比例加入培养基
牛血清白蛋白（BSA）	Sigma-Aldrich	A4503
细胞刺激剂混合物（500 倍浓缩液）（佛波酯 12-十四烷酰佛波醇-13-乙酸酯（PMA）和离子霉素）	eBioscience	00-4970-03	终浓度：PMA 0.081 μM，离子霉素 1.34 μM
THP1 人单核细胞白血病细胞	ATCC	TIB-202
来自产气荚膜梭菌的 V 型胶原酶	Sigma-Aldrich	C9263	培养基中终浓度为 2 mg/mL
二甲基亚砜（DMSO）	Sigma-Aldrich	D2650-100mL
脱氧核糖核酸酶 I（来自牛胰腺 II-S 型）储备液：10 mg/mL 溶于 0.15 M NaCl	Sigma-Aldrich	D4513	消化液中终浓度为 0.025 mg/mL
胎牛血清（FCS）	GE Healthcare	A15-104	在 RPMI 中占 10%
Hamilton 700 系列微量注射器，25 μL 容量，22 号针头，斜面尖端	Fisher Scientific	10100332
青霉素/链霉素	PAA	15140122	青霉素 100 单位/mL，链霉素 100 μg/mL
蛋白转运抑制剂混合物（500 倍浓缩液）（布雷菲德菌素 A 和莫能菌素）	eBioscience	00-4980-03	终浓度 1 倍：布雷菲德菌素 A 10.6 μM，莫能菌素 2 μM
RPMI-1640（含 0.3 g/L 谷氨酰胺）	Sigma-Aldrich	R8758
外科手术刀片 No.10	Swann-Morton	501
胰蛋白酶-EDTA 溶液（10 倍浓缩液）	Sigma-Aldrich	594-18C	终浓度：胰蛋白酶 0.1%，EDTA 0.4%
U 型底 96 孔微孔板	VWR	734-2080