胰腺肿瘤中T细胞的离体刺激：一种提高T细胞细胞因子产生的方法

摘要

来源：Spear, S., 等. 原位胰腺肿瘤的生成及肿瘤浸润性T细胞毒性的离体表征. J. Vis. Exp.(2019)。

本文介绍了用于ex vivo T细胞刺激的技术，以提高T细胞内干扰素-γ（interferon-gamma或IFN-gamma）和肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-alpha或TNF-alpha）等细胞因子的胞内浓度。这些细胞因子 可介导有效的抗肿瘤反应，并在肿瘤治疗中发挥治疗作用。 

方案

1. 胰腺肿瘤的消化

1. 将解剖获得的胰腺肿瘤、转移灶肿瘤或正常胰腺组织置于预冷的磷酸盐缓冲液（PBS）中，并置于冰上保存。
   1. 使用镊子将肿瘤转移至培养皿中。
   2. 向50 mL离心管中加入5.0 mL消化液（2 mg/mL胶原酶，0.025 mg/mL DNase RPMI），并置于冰上以防止酶活性提前启动。
      注意：本方案使用V型胶原酶，其活性为≥1单位/mg FALGPA且>125胶原消化单位（CDU）/mg固体。胶原酶和DNase分装后可于-20 °C保存，使用前在冰上解冻。两者完全溶于无菌RPMI培养基后，可通过0.2 µm滤器去除污染物。过滤前必须确保胶原酶完全溶解，以避免材料损失。
   3. 取少量该溶液覆盖培养皿中的肿瘤组织。
   4. 使用无菌手术刀和镊子将肿瘤切成小块，每块长度约小于3 mm。
   5. 用刮刀将肿瘤碎片刮入离心管中，并轻轻颠倒混匀，直至所有组织块均浸没于消化液中。若需批量处理其他肿瘤样本，可暂时置于冰上保存。
   6. 将离心管置于摇床上，在37 °C孵育20分钟。确保所有肿瘤组织块均浸没于液体中，未贴附于管壁边缘。若无法摇动，则每5分钟涡旋震荡一次以促进消化。

2. 从消化后的肿瘤制备单细胞悬液

1. 消化步骤结束后，....

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
70 μm 孔径细胞滤筛	Fisher Scientific	11597522
抗 CD107a PE（克隆号 1D4B）	Biolegend	121612	按 1:100 比例加入培养基
牛血清白蛋白（BSA）	Sigma-Aldrich	A4503
细胞刺激剂混合物（500 倍浓缩液）（佛波酯 12-十四烷酰佛波醇-13-乙酸酯（PMA）和离子霉素）	eBioscience	00-4970-03	终浓度：PMA 0.081 μM，离子霉素 1.34 μM
THP1 人单核细胞白血病细胞	ATCC	TIB-202
来自产气荚膜梭菌的 V 型胶原酶	Sigma-Aldrich	C9263	培养基中终浓度为 2 mg/mL
二甲基亚砜（DMSO）	Sigma-Aldrich	D2650-100mL
脱氧核糖核酸酶 I（来自牛胰腺 II-S 型）储备液：10 mg/mL 溶于 0.15 M NaCl	Sigma-Aldrich	D4513	消化液中终浓度为 0.025 mg/mL
胎牛血清（FCS）	GE Healthcare	A15-104	在 RPMI 中占 10%
Hamilton 700 系列微量注射器，25 μL 容量，22 号针头，斜面尖端	Fisher Scientific	10100332
青霉素/链霉素	PAA	15140122	青霉素 100 单位/mL，链霉素 100 μg/mL
蛋白转运抑制剂混合物（500 倍浓缩液）（布雷菲德菌素 A 和莫能菌素）	eBioscience	00-4980-03	终浓度 1 倍：布雷菲德菌素 A 10.6 μM，莫能菌素 2 μM
RPMI-1640（含 0.3 g/L 谷氨酰胺）	Sigma-Aldrich	R8758
外科手术刀片 No.10	Swann-Morton	501
胰蛋白酶-EDTA 溶液（10 倍浓缩液）	Sigma-Aldrich	594-18C	终浓度：胰蛋白酶 0.1%，EDTA 0.4%
U 型底 96 孔微孔板	VWR	734-2080