胰腺细胞中钙动力学的成像：一种研究胰岛细胞质钙浓度实时变化的技术

摘要

来源：Hamilton, A.，等。小鼠胰岛细胞亚群中钙动力学的成像。J. Vis. Exp. (2019)。

本视频介绍了实时成像胰岛细胞的技术，用于研究胰岛细胞中少数亚群细胞质内钙离子浓度的变化。可通过功能性反应来鉴定少数细胞亚群，例如利用肾上腺素和饥饿素等标记化合物，这些化合物可诱导胰岛细胞特定亚群中细胞质钙离子浓度发生变化。该方法有助于深入了解血糖水平与胰岛分泌输出之间的相互作用。

方案

1. 加载染料或表达传感器

1. 准备可捕获染料。
   1. 将一份染料（通常为 50 μg）的可捕获染料（例如 Fluo-4）溶解于 DMSO 中，配制成 2 mM 的储存液。加入普流尼克酸（Pluronic acid），使其终浓度为 1%（使用 DMSO 中 20% 的储存液），以改善染料的溶解性。
   2. 将染料分装至小型 PCR 管中（每管 2 μL）。染料可在 -20 °C 冷冻保存数周。
2. 或者，准备重组传感器。
   1. 将传感器（例如编码 GCaMP6f 的腺病毒载体）分装为 10 μL 每份，并在 -80 °C 保存。
   2. （可选）通过使用多个连续稀释度感染胰岛（如下所述）来预先测试病毒储存液的滴度，以确定感染的最佳浓度。
      注意：由不同载体（慢病毒、BacMam、AAV）编码的重组传感器需要不同的感染方案。请务必与载体供应商确认，并根据您的需求优化工作比例。腺病毒的"工作"储存液可在 -20 °C 保存，并可反复冻融数次。过度的冻融循环会降低病毒的有效滴度。
3. 准备成像溶液。
   1. 配制成像溶液（单位：mM）：140 NaCl、4.6 KCl、2.6 CaCl₂、1.2 MgCl₂、1 NaH₂PO₄、5 NaHCO₃、10 HEPES（用 NaOH 调节 pH 至 7.4）。
   2. 在成像溶液中配制葡萄糖（0.5 M）和甘露醇（0.5 M）的储存液。储存液可在冰箱（4 °C）中保存数周。
4. 加载可捕获染料。
   1. 将 2 μL 染料溶解于含 6 mM 葡萄糖的 600 μL 成像溶液中，制成染料工作液。可加热或涡旋以促进溶解。
   2. 将分离的胰岛加入染料工作液中。可使用多孔板或培养皿进行加载。若使用后者，可在非粘附性培养皿（35 mm 或 60 mm）底部放置 100 μL 工作液液滴，并用移液器将 10–30 个胰岛加入液滴中。
   3. 若存在不同组别的胰岛（例如野生型/敲除型），应设置多个孔或多滴液滴，以便同时完成加载。
   4. 将胰岛在室温避光条件下孵育于染料工作液中 70–90 分钟。避免过度孵育。
   5. 在荧光显微镜下检查染料加载情况；胰岛应呈现轻微荧光，部分细胞比其余细胞更亮。细胞变圆及染料在细胞核中定位是染料过载的迹象。
   6. 将胰岛转移至不含染料、含 6 mM 葡萄糖的成像溶液中。胰岛可立即用于成像，但也可选择让染料再脱酯化 10–15 分钟。胰岛可保留染料数小时，因此可用于多次成像实验。
5. 或者，用重组载体感染胰岛。
   1. 将胰岛以液滴形式接种于 RPMI 培养基（RMPI1640（见 材料表），添加 10% 胎牛血清、100 单位/mL 青霉素、100 μg/mL 链霉素）中。将培养基分装至两个 60 mm 的塑料培养皿（未经粘附性处理），并将培养皿置于培养箱中（37 °C、5% CO₂、恒定湿度）。例如，使用 30 μL 液滴，以最小化所需载体体积。
   2. 按每胰岛约 10⁵ 感染单位的比例加入载体，理想情况下应使感染复数>2。理想情况下，应将比例优化至可在胰岛外周层实现表达的最低比例。预滴定（步骤 1.2.2）可能有助于此过程。
   3. 将 20–50 个胰岛加入液滴中，并培养 8–48 小时（理想情况下过夜）。大多数细胞应呈现微弱的绿色荧光，且细胞形态无明显变化。
      注意：感染的成功及表达效果取决于胰岛暴露于病毒溶液的时间。理想情况下，病毒应在溶液中保留过夜，但也可选择在短至 15 分钟后移除。然而，感染效率及因此的表达水平可能会显著降低。

2. 成像 Ca²⁺ 动态变化

1. 在（倒置）显微镜下固定胰岛。
   1. 组装用于倒置显微镜的成像腔室。将玻璃盖玻片（厚度为1或1.5）放置于腔室内，并确保玻璃与腔室之间的接口密封不漏水。检查盖玻片是否处于显微镜物镜的工作范围内（对于体积较大的高数值孔径物镜尤为重要）。
   2. 准备固定配件。从细网和粗网中裁剪出小矩形（20 mm × 20 mm）。插入两个间隔物 "壁" 使用45-50 μm厚的粘性胶带将胰岛固定在细网筛上。如果待成像胰岛的尺寸显著超过常规的100 μm，应使用双层间隔物。
   3. 将网格和重物浸入成像溶液中，使用35 mm的培养皿。确保塑料和金属部分均被溶液浸湿。
   4. 在解剖显微镜下，用隔片转动细网 "壁" 倒置，使垫片朝上。用P20移液器挑选数个负载可捕获染料或表达重组传感器的胰岛，轻轻将其置于细网筛上，位于两个垫片之间。确保网筛和垫圈上不残留过多成像溶液。
   5. 用钟表匠镊子夹起带有胰岛的筛网，将其倒置放入成像室中，使间隔物朝下并直接接触载玻片表面。确保胰岛被夹在间隔物与筛网之间，位于载玻片中央。
   6. 将粗网和重物置于腔室内的细网之上。向腔室内加入成像溶液，确保胰岛已被固定并处于可成像状态。避免剧烈震荡腔室（轻微扰动，如将腔室移至显微镜或将腔室插入加热载物台，是可接受的）。
      注意： 类似的固定装置也可用于直立系统。
2. 设置显微镜。
   1. 选择成像模式和物镜，将步骤2.1中含胰岛的培养皿置于显微镜的温度控制载物台上。
      1. 设置温度控制（理想范围为30 °C至36 °C）和灌流。对于倒置系统，将流入端置于腔室中低于流出端的位置，并使流出流量大于流入流量（通常通过在蠕动泵上使用内径更宽的管路来实现）。
      2. 确保流出端与溶液的接触面积极小，以便以连续多个微小液滴的形式移除溶液，避免长时间连续移除溶液。后者是周期性信号延时成像中的主要伪影来源，表现为所成像的每个像素出现规律性的周期性强度振荡，并常被误认为 "慢波".
      3. 使用含有3 mM葡萄糖的成像溶液开始灌注。
   2. 选择用于绿色荧光染料成像的光路和滤光片；激发波长在470至500之间，发射波长在505至550之间的滤光片组合适用于每种绿色荧光染料。
   3. 进行活体成像以设定成像参数。调整视野以捕获目标胰岛。
   4. 优化图像的信噪比。为此，调节激发光强度、曝光时间和像素合并（binning）参数。确保在尽可能低的光照强度和曝光时间下，仍能清晰地分辨胰岛内每个细胞。
   5. 进行图像采集。根据具体任务，图像采集频率可设置为 0.1 至 5 Hz。该频率远低于快速 Na⁺α细胞和δ细胞中的驱动振荡（>300 Hz），这意味着数据默认处于欠采样状态。然而，在大视野的多细胞/多胰岛成像中，提高采集频率以满足这一需求是不可行的。GCaMP 可以实现更快的成像，而 Fluo4 在快速采集条件下则不可避免地会发生漂白。
      注意： 鉴于[Ca²⁺]_细胞毒性 胰岛细胞中的振荡由电活动驱动，使用较低的采样率似乎适得其反。然而实际上，采样率在约1 Hz或更高时通常足以解析β细胞的放电行为，而要检测由钠通道驱动的α细胞和δ细胞中的振荡，采样率阈值则远高于300 Hz。α细胞或δ细胞中的[Ca²⁺]_细胞 以1 Hz或0.1 Hz采集的振荡信号将严重欠采样，并反映Ca²⁺ 由细胞处理而非电活动。
      1. 检查所获取数据的质量：在3 mM葡萄糖条件下，α细胞活性应清晰可见/可检测。确认满足此条件后，进行大规模的时间序列成像。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
40x/1.3 物镜
GCAMP6f，位于（人5型）腺病毒载体中	Vector Biolabs	1910
胎牛血清	Sigma-Aldrich	F7524-500ML
RPMI 培养基	Thermo Fisher (GibCo, Life Technologies)	61870044
青霉素/链霉素	Thermo Fisher (GibCo, Life Technologies)	15140122
Axiovert 200 显微镜
Fluo4	Thermo Fisher (Life Technologies)	F14201