原代腺泡细胞分离：从小鼠胰腺中分离腺泡细胞的方法

摘要

来源：Fleming Martinez, A. K.，等。在三维细胞培养中模拟与调控胰腺腺泡细胞向导管样细胞的转分化。J. Vis. Exp. (2019)。

本视频介绍了用于分离含有多种消化酶的胰腺腺泡细胞（外分泌细胞）的技术。原代腺泡细胞在 离体 腺泡细胞向导管样细胞转分化（ADM）——胰腺癌发生早期事件的研究

方案

所有涉及动物模型的实验程序均已通过当地机构动物护理委员会以及 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 腺泡细胞的分离

1. 通过 CO₂ 吸入法处死小鼠，并进行颈椎脱位。立即解剖胰腺。解剖胰腺时，先用大头针将小鼠四肢固定在聚苯乙烯盖上，使小鼠尾部朝向操作者，然后用 70% 乙醇喷洒腹部。
   注意： 代表性结果中使用的小鼠为 12 周龄、非转基因雌性 C57BL/6 背景小鼠。小鼠选择在讨论部分有进一步说明。
   1. 使用一套灭菌的剪刀和镊子，用镊子夹起小鼠腹中线处的毛皮/皮肤，用剪刀从尿道口向横膈膜/肋骨区域剪开皮肤和毛皮。
   2. 向左右两侧做额外切口，将毛皮/皮肤剪开，以充分暴露腹腔。随后剪开腹膜（沿中线并向左右两侧剪开），并将其从器官上剥离，方法与剥离毛皮/皮肤相同。
   3. 用镊子提起肠道并将其移至小鼠左侧，以暴露胰腺。胰腺呈淡粉色，与深红色椭圆形的脾脏相连。胰腺组织质地柔软、呈海绵状，易于辨认。将沿胃部走行并与肠道交织的胰腺组织剪下取出。
   4. 将脾脏与胰腺分离。然后将胰腺放入含有 10 mL HBSS（含 1× 青霉素-链霉素）的 50 mL 离心管中，并转移至超净工作台。
      注意： 本实验方案的后续步骤均应在超净工作台中采用无菌技术操作。
2. 将胰腺和含青霉素-链霉素的 HBSS 倒入一个空的称量皿中，用镊子夹住胰腺并在液体中轻轻旋转洗涤。然后用镊子将胰腺转移至第二个含有含青霉素-链霉素 HBSS 的称量皿中，再次旋转洗涤。
3. 将胰腺转移至第三个含有含青霉素-链霉素 HBSS 的称量皿中，开始将胰腺切成 5 mm 或更小的碎块。随后，将胰腺碎块和 HBSS 倒入一个空的 50 mL 离心管中。
   1. 操作时，倾斜称量皿，用镊子将胰腺碎块移入液体中。待所有碎块均脱离称量皿后倾倒液体。用镊子拾取残留碎块，并将镊子在含有胰腺和含青霉素-链霉素 HBSS 的 50 mL 离心管中冲洗。
4. 在 4 °C 条件下以 931 × g 离心 2 分钟，然后用 5 mL 移液器吸除上清液（包括漂浮的脂肪组织）。
5. 向胰腺组织中加入 5 mL 胶原酶（配制方法：将 40 mL HBSS + 5% FBS、20 mL HBSS + 30% FBS 和 5 mL 2 mg/mL 胶原酶溶于 HBSS 中。胶原酶溶液经 0.22 µm 滤器过滤除菌，室温保存。上述 HBSS 溶液均需置于冰上）。用封口膜密封 50 mL 管口，放入 37 °C 摇床中以 220 rpm 振荡消化 20 分钟。
   注意： 胶原酶消化时间可能有所变化，详见讨论部分。消化结束后，不应有大块组织残留。
6. 为终止消化反应，将含胰腺的离心管置于冰上，并加入 5 mL 冷的 HBSS + 5% FBS。在 4 °C 条件下以 931 × g 离心 2 分钟，然后用 5 mL 移液器吸除上清液。
7. 用 10 mL HBSS + 5% FBS 重悬沉淀，在 4 °C 条件下以 931 × g 离心 2 分钟。用 5 mL 移液器吸除上清液，并用另 10 mL HBSS + 5% FBS 重复洗涤一次。
8. 用 5 mL HBSS + 5% FBS 重悬沉淀，使用 P1000 移液器每次转移 1 mL，通过 500 µm 网筛过滤至 50 mL 离心管中。再用 P1000 将额外 5 mL HBSS + 5% FBS 通过网筛冲洗，以确保所有胰腺细胞均通过筛网。
9. 使用 P1000 移液器每次吸取 1 mL，将来自 500 µm 网筛的细胞悬液通过 105 µm 网筛过滤。随后，轻轻吹打细胞悬液，将其转移至含有 HBSS + 30% FBS 的离心管中。细胞悬液将在上层形成一层；离心后，腺泡细胞将沉降形成沉淀。
10. 在 4 °C 条件下以 233 × g 离心 2 分钟。吸除上清液，将沉淀重悬于 1× Waymouth 完全培养基中。
    1. 若后续直接进行细胞在胶原或基底膜基质中的包埋，每只胰腺重悬于 7 mL 培养基中；若后续进行腺病毒或慢病毒感染，则每只胰腺重悬于 4 mL 培养基中。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
37 °C 摇床培养箱	Thermo Scientific	SHKE4000-7
5% CO2，37 °C 培养箱	NUAIRE	NU-5500
50 ml 离心管	Falcon	352070
吸水垫，20" × 24"	Fisherbrand	1420662
BD Precision Glide 针头 21G × 1/2	Fisher Scientific	305167	用作解剖针
烧杯，600 mL	Fisherbrand	FB-101-600
离心机	Beckman Coulter	Allegra X-15R Centrifuge
Ⅰ型胶原酶，产气荚膜梭菌来源	Sigma	C0130-1G	将粉末溶于无菌分子生物学级水中，配制成 100 mg/ml 溶液。解冻一份后，稀释至 10 mg/ml，过滤除菌，并分装为 1 ml 每份，于 -20 °C 保存。
地塞米松	Sigma	D1756	将粉末溶于甲醇中，配制成 4 mg/ml 溶液，分装后于 -20 °C 保存。
乙醇，200 证明	Decon Laboratories	2701
胎牛血清	Sigma	F0926-100mL
镊子	Fine Science Tools	11002-12
镊子	Fine Science Tools	91127-12
不含钙、镁及酚红的汉克平衡盐溶液（HBSS）	Fisher Scientific	SH3048801
矩形冰桶	Fisher Scientific	07-210-103
LAB GUARD 标本袋（用于小鼠解剖后）	Minigrip	SBL2X69S
Parafilm	Bemis	PM992	文稿中称为“塑料石蜡膜”
PBS	Fisher Scientific	SH30028.02
青霉素-链霉素	ThermoFisher Scientific	15140122
移液器吸头，10 µl	USA Scientific	1110-3700
移液器吸头，1000 µl	Olympus Plastics	24-165RL
移液器吸头，200 µl	USA Scientific	1111-1700
Pipet-Aid	Drummond
PIPETMAN Classic P10，1–10 μl	Gilson	F144802
PIPETMAN Classic P1000，200–1000 μl	Gilson	F123602
PIPETMAN Classic P20，2–20 μl	Gilson	F123600
PIPETMAN Classic P200，20–200 μl	Gilson	F123601
移液管，10 ml	Falcon	357551
移液管，25 ml	Falcon	357525
移液管，5 ml	Falcon	357543
聚丙烯筛网，105 µm	Spectrum Labs	146436
聚丙烯筛网，500 µm	Spectrum Labs	146418
剪刀	Fine Science Tools	14568-12
剪刀	Fine Science Tools	14568-13
碳酸氢钠（细白色粉末）	Fisher Scientific	BP328-500
氢氧化钠	Fisher Scientific	S318-500
大豆胰蛋白酶抑制剂	Gibco	17075029
刮勺	Fisherbrand	21-401-10
Steriflip 50 ml，0.22 微米滤器	Millipore	SCGP00525
Ⅰ型大鼠尾胶原	Corning	354236
Waymouth MB 752/1 培养基（粉末）	Sigma	W1625-10X1L
称量舟，六角形，中号	Fisherbrand	02-202-101