腺泡-导管化生诱导：一种在三维离体培养中研究腺泡细胞向导管细胞分化的实验方法

摘要

来源：Fleming Martinez, A. K. 等。在三维细胞培养中模拟与调控胰腺腺泡细胞向导管细胞转分化。J. Vis. Exp. (2019)。

本视频介绍了在体外三维培养中将胰腺腺泡细胞分化为导管细胞的技术。该技术有助于理解调控腺泡细胞向导管细胞转分化（ADM）的机制，ADM是胰腺癌早期发生的关键过程。

方案

所有涉及动物模型的实验程序均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 材料、溶液及三维基质的制备

1. 将500 µm和105 µm的聚丙烯网分别裁剪成76 mm × 76 mm的正方形。将每个正方形连续对折两次，形成更小的折叠正方形。将一片500 µm和一片105 µm的网片放入一个可高压灭菌的袋中。
2. 对聚丙烯网片以及两把剪刀和镊子进行高压灭菌。
3. 配制100 mL 10倍浓度的Waymouth's溶液。将1瓶（14 g）Waymouth's粉末加入50 mL去离子水（DI水）中搅拌溶解，溶解后加入30 mL 7.5%（75 g/L）碳酸氢钠溶液。用去离子水定容至100 mL，并通过过滤除菌。
   1. 将10倍浓度的Waymouth's培养基储存于4 °C，用于配制胶原凝胶和1倍浓度的Waymouth's培养基。若出现沉淀，则弃用。
4. 根据每个胰腺的需求，配制50 mL 1倍浓度的完全Waymouth's培养基：加入125 µL 40 mg/mL的大豆胰蛋白酶抑制剂、12.5 µL 4 mg/mL的地塞米松和500 µL胎牛血清（FBS）。过滤除菌后，48小时内使用。
5. 使用胶原蛋白或基底膜基质（参见材料表获取产品信息）制备三维基质基底。加样时将培养板置于冰上，避免产生气泡，并在每孔加样后立即轻轻旋转培养板，以确保基底完全覆盖。
   1. 在冰上、于细胞培养超净台中混合以下组分，制备胶原基底：5.5 mL I型大鼠尾胶原蛋白、550 µL 10倍浓度Waymouth's培养基和366.6 µL 0.34 M NaOH（已过滤）。
      注意：此体积足以制备一个24孔板、12孔板或6孔板的胶原基底。一个培养板足以用于一个胰腺的腺泡细胞分离。
   2. 使用以下体积进行胶原基底铺板：80 µL（8孔玻片）、200 µL（24孔板）、400 µL（12孔板）或800 µL（6孔板）。
   3. 对于基底膜基质基底，直接移取基质，无需添加其他组分。每孔使用以下体积：50 µL（8孔玻片）、120 µL（24孔板）、240 µL（12孔板）或600 µL（6孔板）。
   4. 将基底在细胞培养孵箱（37 °C，5% CO₂）中静置至少30分钟，使其充分凝固，然后在其上构建含细胞的第二层基质。
6. 为进行腺泡细胞分离，准备一个600 mL烧杯、三个50 mL离心管、一把已灭菌的剪刀、一把已灭菌的镊子，以及一个装有冰的冰桶，并在超净台内放置三个称量皿。然后配制30 mL HBSS，加入300 µL 100倍浓度的青霉素-链霉素溶液，将其中10 mL分别加入两个称量皿中，剩余10 mL保留在一个50 mL离心管中（用于步骤1.8.2和2.1.4）。
7. 配制40 mL含5% FBS的HBSS、20 mL含30% FBS的HBSS，以及5 mL含2 mg/mL胶原酶的HBSS。胶原酶溶液需经0.22 µm滤膜过滤除菌，并置于室温保存。其余HBSS溶液均需置于冰上。
8. 准备胰腺解剖工作区，可在实验台面上进行。
   1. 在桌面上放置一张吸水垫，并在其上覆盖一张覆有铝箔的聚苯乙烯盖。然后在铝箔上放置一张带有4个固定针的纸巾。
   2. 在解剖工作区附近备好以下物品：一个焚烧袋、一套已灭菌的剪刀和镊子、一瓶70%乙醇喷雾剂，以及一个装有冰的冰桶（内含步骤1.6中配制的含青霉素-链霉素的HBSS 50 mL离心管）。
9. 将离心机预冷至4 °C，摇床预热至37 °C。

2. 腺泡细胞的分离

1. 通过 CO₂ 吸入法处死小鼠，并实施颈椎脱位。立即解剖胰腺。解剖胰腺时，先用大头针将小鼠的四肢固定在聚苯乙烯盖上，使小鼠尾部朝向操作者，然后用 70% 乙醇喷洒腹部。
   注意： 代表性结果中使用的小鼠为 12 周龄、非转基因雌性 C57BL/6 背景小鼠。小鼠选择在讨论部分有进一步说明。
   1. 使用一套已灭菌的剪刀和镊子，用镊子夹起小鼠腹中线处的毛皮/皮肤，用剪刀从尿道口至横膈膜/肋骨区域剪开毛皮和皮肤。
   2. 向左右两侧做额外切口，将毛皮/皮肤剪开，以充分暴露腹腔。随后剪开腹膜（沿中线并向左右两侧剪开），并将其从器官上剥离，方法与剥离毛皮/皮肤相同。
   3. 用镊子提起肠道并将其移至小鼠左侧，以暴露胰腺。胰腺呈淡粉色，与深红色椭圆形的脾脏相连。胰腺组织质地柔软、呈海绵状，易于辨认。将沿胃部走行并与肠道交织的胰腺组织剪下取出。
   4. 将脾脏与胰腺分离。然后将胰腺放入含有 10 mL HBSS（含 1× 青霉素-链霉素）的 50 mL 离心管中，并转移至超净工作台。
      注意： 本实验方案的后续步骤均应在超净工作台中采用无菌技术操作。
2. 将胰腺和含青霉素-链霉素的 HBSS 倒入一个空的称量皿中，用镊子夹住胰腺并在液体中轻轻旋转洗涤。然后用镊子将胰腺转移至第二个盛有含青霉素-链霉素 HBSS 的称量皿中，再次通过旋转进行洗涤。
3. 将胰腺转移至第三个盛有含青霉素-链霉素 HBSS 的称量皿中，开始将胰腺切成 5 mm 或更小的碎块。随后，将胰腺碎块和 HBSS 倒入一个空的 50 mL 离心管中。
   1. 操作时，倾斜称量皿，用镊子将胰腺碎块移入液体中。待所有碎块均脱离称量皿后倾倒液体。用镊子拾取残留碎块，并将镊子在含有胰腺和含青霉素-链霉素 HBSS 的 50 mL 离心管中冲洗。
4. 在 4 °C 条件下以 931 × g 离心 2 分钟，然后用 5 mL 移液器吸除上清液（包括任何漂浮的脂肪组织）。
5. 向胰腺组织中加入 5 mL 胶原酶（在步骤 1.7 中已用 HBSS 稀释）。用封口膜密封 50 mL 离心管管口，然后将其置于 37 °C 摇床中，以 220 rpm 振荡孵育 20 分钟。
   注意： 胶原酶消化时间可能有所不同，详见讨论部分。孵育结束后，不应有大块组织残留。
6. 为终止消化反应，将含有胰腺的离心管置于冰上，并加入 5 mL 冷的 HBSS + 5% FBS。在 4 °C 条件下以 931 × g 离心 2 分钟，然后用 5 mL 移液器吸除上清液。
7. 用 10 mL HBSS + 5% FBS 重悬沉淀，在 4 °C 条件下以 931 × g 离心 2 分钟。用 5 mL 移液器吸除上清液，并用另 10 mL HBSS + 5% FBS 重复此洗涤步骤一次。
8. 用 5 mL HBSS + 5% FBS 重悬沉淀，使用 P1000 移液器每次转移 1 mL，通过 500 µm 网筛滤入 50 mL 离心管中。再用 P1000 将额外 5 mL HBSS + 5% FBS 通过网筛冲洗，以确保所有残留的胰腺细胞均被洗入管中。
9. 使用 P1000 移液器每次吸取 1 mL，将来自 500 µm 网筛的细胞悬液通过 105 µm 网筛过滤。随后，轻轻吹打将细胞悬液转移至含有 HBSS + 30% FBS 的离心管中。细胞悬液将在上层形成一层；离心后，腺泡细胞将沉降形成沉淀。
10. 在 4 °C 条件下以 233 × g 离心 2 分钟。吸除上清液，并将沉淀重悬于 1× Waymouth 完全培养基中。
    1. 若需直接将细胞包埋于胶原蛋白或基底膜基质中，则按每只胰腺 7 mL 的体积重悬；若需进行腺病毒或慢病毒感染，则按每只胰腺 4 mL 的体积重悬。

3. 病毒感染

1. 由于一个胰腺的细胞足以用于两次病毒感染（对照组和实验组，例如 null 和 cre），可将细胞悬液分装至两个 35 mm 培养皿的皿盖中。使用培养皿的皿盖可在悬液中进行感染，从而便于后续转移至最终基质。
   1. 操作病毒时，所有使用过的移液枪头需浸泡于 10% 次氯酸钠溶液中至少 15 分钟。
      注意：对于 8 至 16 周龄的非转基因小鼠来源的细胞，使用 35 mm 培养皿和 4 mL 体积效果良好。对于胰腺较小或较大的动物，可能需要调整培养皿尺寸和体积。
2. 进行腺病毒感染时，将病毒（滴度至少为 10⁷ TU/mL）按 1:1,000 稀释后加入每个培养皿的皿盖中，并轻轻混匀（图 1，GFP 腺病毒）。将培养皿置于细胞培养箱中（37 °C，5% CO₂），每 15 分钟轻摇一次，持续 1 小时。继续孵育额外 2 小时，随后进行细胞在胶原或基底膜基质中的包埋。
3. 在生物安全柜内完成病毒相关操作后，将安全柜内所有组件用 10% 次氯酸钠溶液浸泡至少 15 分钟，然后用 70% 乙醇彻底清洗去除残留的次氯酸钠。

4. 细胞在胶原蛋白或基底膜基质中的包埋

1. 在冰上制备胶原凝胶：将7 mL I型大鼠尾胶原蛋白（3.3 mg/mL）、700 µL 10倍浓度的Waymouth培养基和466.6 µL 0.34 M NaOH混合。
2. 取等体积的胶原凝胶与细胞悬液，轻轻混匀。若需添加刺激剂或抑制剂，将其一并加入胶原-细胞悬液中。每次处理一个孔（使用步骤1.5.3中的培养板），保持培养板置于冰上，轻轻摇晃使胶原-细胞层均匀分布。
   1. 每孔加入以下体积的胶原-细胞悬液：200 µL（8孔玻片）、500 µL（24孔板）、1000 µL（12孔板）或2000 µL（6孔板）。注意，在图1中，ADM通过TGF-α（50 ng/mL）刺激诱导产生。
3. 如需将细胞包埋于基底膜基质中，按1份基底膜基质与2份细胞悬液的比例混合。与胶原凝胶类似，保持基质-细胞悬液及培养板处于冰上。每次处理一个孔，使用与4.2.1中相同的加样体积，并轻轻摇晃以确保均匀分布。
4. 将培养板放入细胞培养孵箱（37 °C，5% CO₂）中孵育30分钟以使凝胶固化，随后加入含刺激剂或抑制剂的1倍浓度Waymouth完全培养基（图1中使用50 ng/mL TGF-α）。次日更换含刺激剂或抑制剂的新鲜培养基，之后每隔一天更换一次。根据所用刺激剂的不同，ADM可在第3至第5天之间观察到。

结果

图1：经TGF-α刺激后，在胶原蛋白中培养的原代腺泡细胞的代表性结果。 来自非转基因小鼠的原代腺泡细胞用GFP腺病毒进行感染，包埋于I型胶原或基底膜基质中，并在有或无TGF-α（50 ng/mL）的条件下进行刺激。GFP腺病毒感染后24小时拍摄图像以评估感染效率。感染后第5天的图像显示了在胶原或基底膜基质中，有或无TGF-α刺激条件下细胞的差异。类导管结构由白色箭头指示，比例尺为50 µm。图像使用共聚焦显微镜配合EC Plan-Neofluar 10x/0.3 M27物镜获取。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
5% CO2, 37 °C 培养箱	 NUAIRE 	NU-5500
50 ml 离心管 	 Falcon	352070
烧杯，600 mL	Fisherbrand	  FB-101-600
腺病毒 Ad-GFP  	 Vector Biolabs	1060
地塞米松  	Sigma	 D1756	将粉末溶于甲醇，配制成 4 mg/ml 溶液，分装后于 -20 °C 保存
胎牛血清  	Sigma	F0926-100mL
镊子  	Fine Science Tools	11002-12
玻璃载玻片，8 孔  	Lab-Tek	177402
矩形冰桶 	 Fisher Scientific	07-210-103
Matrigel  	Corning	356234	文稿中称为“基底膜基质”。
PBS  	Fisher Scientific	SH30028.02
青霉素-链霉素溶液  	ThermoFisher Scientific	15140122
培养板，12 孔 	Corning Costar	3513
培养板，24 孔  	Corning Costar	3524
培养板，6 孔 	 Falcon	353046
聚丙烯筛网，105 µm  	Spectrum Labs	146436
聚丙烯筛网，500 µm  	Spectrum Labs	146418
剪刀  	Fine Science Tools	14568-12
碳酸氢钠（细白色粉末）  	Fisher Scientific	BP328-500
氢氧化钠  	Fisher Scientific	S318-500
大豆胰蛋白酶抑制剂  	Gibco	17075029
I 型大鼠尾胶原 	 Corning	354236
PIPETMAN Classic P10，1–10 μl	 Gilson	F144802
移液管，5 ml 	 Falcon 	357543
移液器吸头，10 µl 	USA Scientific	 1110-3700
移液器吸头，1000 µl	 Olympus Plastics	 24-165RL
移液器吸头，200 µl 	USA Scientific	 1111-1700 
移液管，25 ml	 Falcon 	357525
移液辅助器（Pipet-Aid） 	Drummond
移液管，10 ml	 Falcon 	357551
PIPETMAN Classic P200，20–200 μl 	 Gilson	F123601
PIPETMAN Classic P1000，200–1000 μl	 Gilson	F123602
PIPETMAN Classic P20，2–20 μl 	 Gilson	F123600 
Waysmouth MB 752/1 培养基（粉末） 	Sigma	 W1625-10X1L
称量舟，六角形，中号  	Fisherbrand	02-202-101