通过胶原酶灌注法分离胰岛：一种分离胰岛细胞的酶消化方法

摘要

来源：Villarreal D. 等. 一种简单高效的小鼠胰岛分离方案. J. Vis. Exp. (2019)

胰岛，也称为朗格汉斯岛，是一类内分泌细胞簇，可产生调节葡萄糖及其他重要生物学功能所需的激素。本方案介绍了一种从小鼠胰腺中分离胰岛的方法：首先通过十二指肠乳头灌注胶原酶，以消化外分泌胰腺组织，再采用简化的密度梯度离心法纯化胰岛。

方案

所有涉及动物模型的操作均已被当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会审核。

所需的手术器械如图1所示，手术流程的示意图如图2所示。

1. 溶液

1. 通过将100 mL的10X Hank’s平衡盐溶液（HBSS）（来自储备液）加入900 mL蒸馏水中，配制1 L的1X HBSS溶液。
2. 通过将50 mL的100X胎牛血清（FBS）加入450 mL冰浴预冷的1X HBSS中，现配制STOP溶液（必须现配并在1小时内使用），配制成500 mL STOP溶液。将STOP溶液置于4 °C保存。
3. 通过将1 mg/mL的胶原酶P（collagenase P）加入冰浴预冷的1X HBSS中，现配制胶原酶P溶液（必须在使用前1小时内配制）；每只小鼠使用6 mL。
   1. 向胶原酶P溶液中加入0.05%（w/v）牛血清白蛋白（BSA）（为分离的胰岛提供营养）。例如，在6 mL胶原酶P溶液中加入3 mg BSA。置于冰上保存。
   2. 计算并准备所有小鼠所需的胶原酶P总量，置于一个50 mL离心管中。
4. 通过向500 mL含5.5 mM葡萄糖的RPMI 1640培养基中添加10% FBS、100 U/mL青霉素、100 µg/mL链霉素以及INS-1细胞补充剂（10 mM HEPES、2 mM L-谷氨酰胺、1 mM丙酮酸钠和0.05 mM 2-巯基乙醇），配制完全RPMI 1640培养基，用于过夜培养和孵育。

2. 准备

1. 准备三个50 mL离心管，每管加入25 mL RNase抑制溶液、70%乙醇或蒸馏H₂O。这些溶液将在手术前及手术过程中用于清洁手术器械。
2. 在开始实验方案前，将器械尖端浸泡于RNase抑制溶液中30分钟，以彻底清除器械上可能存在的RNase。
3. 预先将吸水垫裁剪为6英寸×6英寸大小，供手术期间使用。
4. 提前配制1X HBSS溶液，并于4 °C保存。手术前配制STOP溶液，并同样置于4 °C保存。
5. 手术前立即配制collagenase P溶液，并置于冰上保存。
   注意：该溶液应在配制后2小时内使用完毕。
6. 标记用于消化和纯化的50 mL离心管；每只小鼠准备2管，一管用于消化，另一管用于胰岛纯化。确保两只管上均标注动物编号。
7. 向第一支50 mL离心管中加入3 mL collagenase P溶液。剩余的3 mL collagenase P溶液将用于注射。
8. 用装有30 G ½英寸针头的3 mL注射器吸取剩余的3 mL collagenase溶液，并将注射器置于冰上备用。

3. 实验步骤

1. 将所有工具从RNase抑制溶液中取出后，先浸入盛有70%乙醇的试管中，再浸入装有蒸馏H₂O的试管中₂然后在干净的纸巾上风干。
2. 将小鼠放入含有0.5 mL异氟烷的麻醉 chamber 中，直至小鼠深度麻醉。
3. 将小鼠从舱室中取出，用镊子夹捏足垫以检查麻醉状态。深度麻醉的判断依据为呼吸变得持续缓慢，且小鼠对足部夹捏无反应。确认小鼠已深度麻醉后，采用颈椎脱位法处死小鼠，随后将小鼠置于吸水垫上。
   1. 将麻醉后的小鼠置于俯卧位，按压颈部，并通过牵拉尾巴使脊髓与脑部分离。
4. 将小鼠仰卧位固定于吸水垫上，用70%乙醇喷洒其体表，并擦去多余乙醇。
5. 使用盖玻片镊子和弯头手术剪进行切口。首先在腹部皮肤做一横向切口（约3 cm），将皮肤充分拉开，暴露腹壁；然后在腹膜做一纵向切口（约3–4 cm），以充分暴露腹腔内的胰腺。图3).
6. 将肝脏的叶向上推，以暴露胆管，胆管呈淡粉色管状结构（图3).
7. 小心地将腹腔右腰/髂区的肠管移向右侧，暴露胆管和肝动脉（图3).
8. 使用 Schwartz 微型止血钳小心夹住胆总管图1尽可能靠近肝脏。
9. 识别位于十二指肠乳头处的法特壶腹，该结构由胰管与胆总管汇合而成。在解剖显微镜下观察，法特壶腹呈现肿胀状，为胆总管的入口。图 4).
   注意： 调节解剖显微镜的光照强度和角度有助于更清晰地定位。
10. 将含有3 mL胶原酶P溶液的注射器插入Vater壶腹。将针头推入胆管，深度约为胆总管长度的1/4（壶腹通入胆管），如图所示。 图5.
11. 针头进入壶腹后，应确保针头方向与胆管平行。
12. 用微型Adson镊子夹住针头以固定，防止其刺破导管图5).
13. 缓慢而稳定地将注射器中的3 mL胶原酶P溶液注入胆总管（注入至有阻力感为止），如图所示。 图6目的是产生反向压力，迫使胶原酶进入胰管。若胰腺的头部、颈部、体部和尾部区域均完全膨胀，则视为注射成功。
    注意： 如果胰腺未充分膨胀，或脾脏区域未充分膨胀，胰岛产量将会较低。脾脏区域含有最丰富的胰岛。⁶可通过观察胰腺组织间出现充满溶液的空隙来确认充盈状态。
14. 小心地解剖出肿大的胰腺，并将其放入含有3 mL冰冻的胶原酶P溶液的50 mL消化管中。
    1. 使用两把镊子（弯镊和显微有齿镊；参见 图1）：（从脾脏开始，将胰腺从脾脏分离，并继续沿胃部及十二指肠方向剥离。
       注意： 无需切口。
    2. 用精细手术剪在消化管中将胰腺剪碎3–5秒，加入3 mL冰冷的胶原酶P溶液图7A).
15. 将试管固定在37 °C水浴中的试管架上，以100–120 rpm振荡约12–13分钟。
16. 孵育后，用手轻轻振荡试管以破碎组织，直至胶原酶P消化液变得均匀图7B）。通过观察胰腺组织是否呈现细沙状颗粒来确认匀浆的均匀性。通常轻轻手动振荡约30秒即可。将离心管置于光线下观察组织是否充分匀浆；若需要，可再振荡约15秒。
17. 消化完成后，立即将试管置于冰上，并加入40 mL预冷的STOP溶液以终止酶消化反应。
    注意： 此时，若同时处理多只小鼠，消化管可在冰上放置最多2小时。
18. 将试管放入摆桶式离心机中，以 300 x g 30 秒（离心机温度可调）。
    注意： 使用水平转子离心机，使组织沉淀位于50 mL离心管底部而非管壁上；这对于提高胰岛得率至关重要。
19. 倾去上清液，再用 STOP 溶液重复离心 2 次，每次离心后均倾去溶液。每次后续洗涤使用 20 mL STOP 溶液。
    1. 每次离心前，将组织沉淀物在含有 20 mL STOP 溶液的 50 mL 离心管中轻轻振荡，以充分分散沉淀。
20. 用40 mL预冷的HBSS重悬组织沉淀，300 x g离心 g 30 秒。
21. 倾去上清液，使用水平转子离心机，用HBSS溶液再重复离心两次，每次离心后均倾去上清液。每次洗涤使用20 mL HBSS。
    1. 每次离心前，轻轻振荡含有20 mL HBSS溶液的离心管，以重悬沉淀并使其脱离管底。
22. 最后一次离心后，去除所有 HBSS。
23. 然后向含有沉淀的50 mL离心管中加入5 mL室温密度梯度液。低速涡旋振荡片刻，直至混匀。
24. 向50 mL离心管中再加入5 mL室温密度梯度液。 不要涡旋/混合。
    注意： 它是 关键的 到 保持稳定且静止 以便形成更佳的梯度，且不造成干扰。
25. 将10 mL室温HBSS缓冲液用移液器加入含有密度梯度的离心管中， 逐滴轻柔地 和 缓慢地 以形成梯度。使用带有10 mL移液管的移液器逐滴加入HBSS。
26. 使用水平转子离心机，以1700 x g 15分钟。务必将加速和减速的速度均调至最低档，以保持梯度稳定（图7C).
27. 离心后，小心取出离心管，避免扰动密度梯度。使用预先用冷的HBSS润洗过的移液枪（将HBSS上下吸取数次），吸取位于密度梯度与HBSS之间的胰岛层（5–10 mL），转移至新的50 mL胰岛收集管中。
    注意： 用冷的HBSS润洗移液器，有助于防止胰岛在移液过程中粘附于移液器内壁。
    1. 如果分离不完全，可在密度梯度层中观察到胰岛，此时用移液器吸出全部10 mL密度梯度液（底层）以及在界面处形成的胰岛层（仅保留约8–10 mL HBSS上层液体）。
       注意： 同时收集胰岛层和密度梯度层（底层）可能会导致收集到碎片，从而延长胰岛挑选时间，但不会影响其他步骤。当胰岛层形态良好时，无需同时收集这两层。
28. 向含有胰岛的新50 mL离心管中加入20 mL冰冻HBSS，然后以350 x g 在摆动桶式离心机中离心3分钟。
29. 离心后，小心地用移液器吸取（不要倾倒吸出上清液（底部保留约3 mL），注意不要扰动底部含有胰岛的沉淀。弃去上清液。
30. 重复洗涤和离心至少3次，每次加入20 mL HBSS，并确保每次离心前充分重悬沉淀。
31. 将 RPMI-1640 完全培养基瓶置于 37 °C 水浴中预热后再使用。最后一次离心后，弃去所有 HBSS，向沉淀中加入 4 mL 预先配制好的含 FBS、INS-1 细胞添加剂和青霉素/链霉素的完全 RPMI-1640 培养基。
32. 轻轻旋转离心管使沉淀物悬浮，立即将RPMI-1640培养基倒入一个100 mm的培养皿中。向离心管中再加入5 mL RPMI-1640培养基，轻轻旋转以冲洗残留的胰岛，并将此培养基也倒入同一培养皿中。
    1. 在解剖显微镜下，使用20 µL移液器从培养皿中挑选健康的胰岛，转移至含有10 mL完全RPMI 1640培养基的新培养皿中。在解剖显微镜下观察，胰岛应呈球形或椭圆形，色泽为金棕色，表面光滑，与相对透明、纤细的外分泌组织相区别。
       注意： 解剖显微镜的放大倍数通常设置为12.5–16倍。胰岛产量会因小鼠品系、年龄和性别等不同因素而有所差异。本方案通常可从4–10月龄健康的C57BL/6J小鼠获得250–350个健康的胰岛。
33. 在无菌培养箱中，于37 °C、5% CO₂条件下孵育胰岛₂ 用于次日实验时，可将胰岛置于含95%湿润空气的环境中过夜灌注；若需在后续时间进行特定分析，则可将胰岛冷冻保存。
    1. 胰岛一旦冻存，便无法再用于分泌实验，仅可用于RNA或蛋白质定量。为收集待冻存的细胞，需将其置于HBSS缓冲液中，收集全部胰岛于200–500 µL缓冲液内，转移至1.5 mL离心管，以350 x g 静置1–2分钟，弃去上清液，残留液体不超过30–40 µL，置于-20 °C短期保存（数天）或-80 °C长期保存。

结果

图1：手术工具。
图中所示工具包括弯头手术剪、盖玻片镊、微型Adson镊、弯头镊、小型手术剪以及Schwartz微血管止血夹（微血管钳）。请点击此处查看该图的放大版本。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
3 mL 注射器 	BD 	309657	用于盛装胶原酶 P
盖玻片镊子 	VWR 	82027-396 	夹持小鼠皮肤以辅助切口操作
弯头镊子 	Sigma-Aldrich 	Z168696 	在胰腺摘除过程中夹持组织
100 mm 培养皿	 VWR 	30-2041 	用于胰岛培养
30 G. ½ 英寸针头 	BD 	305106	用于穿刺壶腹以注入胶原酶 P —— 选用此规格是因为其可良好适配大多数胆总管
50 mL 离心管	VWR 	89039-658 	用于盛装消化后的胰腺组织、胶原酶 P 及纯化的胰岛
带防水<br/> 防潮层的吸水垫	VWR	&nbsp;82020-845&nbsp;	用于吸收手术过程中的血液
配备摆动吊篮及减速功能的<br/> 5810R 离心机	Eppendorf&nbsp;	5811FJ478114&nbsp;	用于沉淀组织，沉淀物形成于锥形管底部 —— 必须使用摆动吊篮式离心机。此外，减速功能对于形成梯度层至关重要
胶原酶 P - 1 g&nbsp;	Roche Diagnostics&nbsp;	11249002001	用于消化外分泌胰腺组织
弯头手术剪&nbsp;	Fisher-Scientific&nbsp;	13-804-21&nbsp;	用于剪开小鼠腹腔
解剖显微镜&nbsp;	Olympus&nbsp;	SZX16&nbsp;	用于识别关键解剖结构，以准确<br/> 将胶原酶注入胰腺
Hank's 平衡盐溶液 10x	Corning&nbsp;	20-023-CV&nbsp;	用于细胞洗涤
Histopaque-1077&nbsp;	Sigma&nbsp;	RNBF5100&nbsp;	用于形成密度梯度
光源&nbsp;	Leeds&nbsp;	LR92240&nbsp;	增强显微镜的可视性
不含 L-谷氨酰胺的 RPMI-1640 培养基&nbsp;	Corning&nbsp;	15-040-CV&nbsp;	用于胰岛培养
Schwartz 微型止血钳（微血管夹）&nbsp;	Fine Science Tools&nbsp;	18052-01	用于夹闭胆总管和<br/> 肝动脉
振荡水浴箱	&nbsp;Boekel/Grant&nbsp;	8R0534008	对胰腺外分泌组织的机械消化至关重要
小型手术剪&nbsp;	VWR&nbsp;	82027-578&nbsp;	用于剪除附着在胰腺上的组织
RNaseZap&nbsp;	Fisher-Scientific	&nbsp;AM9780&nbsp;	用于去除 RNase
异氟烷&nbsp;	Piramal&nbsp;	B13B16A&nbsp;	用于手术前麻醉小鼠