通过胶原酶灌注法分离胰岛：一种分离胰岛细胞的酶消化方法

摘要

来源：Villarreal D. 等. 一种简单高效的小鼠胰岛分离方案. J. Vis. Exp. (2019)

胰岛，也称为朗格汉斯岛，是一类内分泌细胞簇，可产生调节葡萄糖及其他重要生物学功能所需的激素。本方案介绍了一种从小鼠胰腺中分离胰岛的方法：首先通过十二指肠乳头灌注胶原酶，以消化外分泌胰腺组织，再采用简化的密度梯度离心法纯化胰岛。

方案

所有涉及动物模型的操作均已被当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会审核。

所需的手术器械如图1所示，手术流程的示意图如图2所示。

1. 溶液

1. 通过将100 mL的10X Hank’s平衡盐溶液（HBSS）（来自储备液）加入900 mL蒸馏水中，配制1 L的1X HBSS溶液。
2. 通过将50 mL的100X胎牛血清（FBS）加入450 mL冰浴预冷的1X HBSS中，现配制STOP溶液（必须现配并在1小时内使用），配制成500 mL STOP溶液。将STOP溶液置于4 °C保存。
3. 通过将1 mg/mL的胶原酶P（collagenase P）加入冰浴预冷的1X HBSS中，现配制胶原酶P溶液（必须在使用前1小时内配制）；每只小鼠使用6 mL。
   1. 向胶原酶P溶液中加入0.05%（w/v）牛血清白蛋白（BSA）（为分离的胰岛提供营养）。例如，在6 mL胶原酶P溶液中加入3 mg BSA。置于冰上保存。
   2. 计算并准备所有小鼠所需的胶原酶P总量，置于一个50 mL离心管中。
4. 通过向500 mL含5.5 mM葡萄糖的RPMI 1640培养基中添加10% FBS、100 U....

结果

图1：手术工具。
图中所示工具包括弯头手术剪、盖玻片镊、微型Adson镊、弯头镊、小型手术剪以及Schwartz微血管止血夹（微血管钳）。请点击此处查看该图的放大版本。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
3 mL 注射器 	BD 	309657	用于盛装胶原酶 P
盖玻片镊子 	VWR 	82027-396 	夹持小鼠皮肤以辅助切口操作
弯头镊子 	Sigma-Aldrich 	Z168696 	在胰腺摘除过程中夹持组织
100 mm 培养皿	 VWR 	30-2041 	用于胰岛培养
30 G. ½ 英寸针头 	BD 	305106	用于穿刺壶腹以注入胶原酶 P —— 选用此规格是因为其可良好适配大多数胆总管
50 mL 离心管	VWR 	89039-658 	用于盛装消化后的胰腺组织、胶原酶 P 及纯化的胰岛
带防水<br/> 防潮层的吸水垫	VWR	&nbsp;82020-845&nbsp;	用于吸收手术过程中的血液
配备摆动吊篮及减速功能的<br/> 5810R 离心机	Eppendorf&nbsp;	5811FJ478114&nbsp;	用于沉淀组织，沉淀物形成于锥形管底部 —— 必须使用摆动吊篮式离心机。此外，减速功能对于形成梯度层至关重要
胶原酶 P - 1 g&nbsp;	Roche Diagnostics&nbsp;	11249002001	用于消化外分泌胰腺组织
弯头手术剪&nbsp;	Fisher-Scientific&nbsp;	13-804-21&nbsp;	用于剪开小鼠腹腔
解剖显微镜&nbsp;	Olympus&nbsp;	SZX16&nbsp;	用于识别关键解剖结构，以准确<br/> 将胶原酶注入胰腺
Hank's 平衡盐溶液 10x	Corning&nbsp;	20-023-CV&nbsp;	用于细胞洗涤
Histopaque-1077&nbsp;	Sigma&nbsp;	RNBF5100&nbsp;	用于形成密度梯度
光源&nbsp;	Leeds&nbsp;	LR92240&nbsp;	增强显微镜的可视性
不含 L-谷氨酰胺的 RPMI-1640 培养基&nbsp;	Corning&nbsp;	15-040-CV&nbsp;	用于胰岛培养
Schwartz 微型止血钳（微血管夹）&nbsp;	Fine Science Tools&nbsp;	18052-01	用于夹闭胆总管和<br/> 肝动脉
振荡水浴箱	&nbsp;Boekel/Grant&nbsp;	8R0534008	对胰腺外分泌组织的机械消化至关重要
小型手术剪&nbsp;	VWR&nbsp;	82027-578&nbsp;	用于剪除附着在胰腺上的组织
RNaseZap&nbsp;	Fisher-Scientific	&nbsp;AM9780&nbsp;	用于去除 RNase
异氟烷&nbsp;	Piramal&nbsp;	B13B16A&nbsp;	用于手术前麻醉小鼠