类球体的免疫荧光染色：一种用于分析类球体胞内和胞外抗原表达的技术

摘要

来源：Cavaco, A. C. M. 等. 一种三维球体模型作为更接近生理条件的体系用于体外研究癌相关成纤维细胞的分化与侵袭. J. Vis. Exp. (2019)。

本视频介绍了对球状体进行免疫荧光染色的技术，以研究成纤维细胞或癌症相关成纤维细胞（CAFs）的分化情况。该方案有助于检测球状体内细胞内和细胞外抗原的表达，包括细胞外基质（ECM）蛋白的沉积。

方案

1. 类球体的免疫荧光染色

1. 在约24小时后，将每种实验条件或每种待分析蛋白对应的类球体收集至一个1.5 mL离心管中。例如，将经TGF-β1刺激的iNF类球体置于与未处理对照组iNF类球体不同的离心管中。为避免因过强剪切力导致类球体破裂，可剪切移液器吸头末端以扩大孔径。每个离心管中至少包含5–10个类球体，以便设置重复样本，并考虑洗涤步骤中可能的损失。
2. 使用台式离心机以1,000 × g离心约30–60秒。小心吸去含甲基纤维素的上清液，避免扰动沉淀的类球体。
3. 用50 µL 1× PBS洗涤一次。重复步骤1.2中的离心操作，并按所述方法小心吸去PBS。
4. 根据待染色蛋白的不同，在室温下用50 µL含4%多聚甲醛的PBS固定20分钟（适用于αSMA、NG2和整合素α3β1），或在-20 °C下用50 µL甲醇固定10分钟（适用于层粘连蛋白-332亚基）。
5. 重复步骤1.2–1.3所述的洗涤步骤。
6. 在室温下用含0.1% Triton-X的PBS处理4分钟，以通透细胞。
7. 重复步骤1.2–1.3所述的洗涤步骤共三次。
8. 将类球体置于含5% FBS和2% BSA的PBS中，在室温下孵育1小时，以封闭非特异性蛋白结合位点。
9. 将类球体与30 µL一抗溶液（PBS中含2.5% FBS和1% BSA）在4 °C下孵育过夜。所使用的一抗包括：Cy-3标记的抗αSMA抗体和抗NG2抗体（5 µg/mL）；BM2抗层粘连蛋白α3、6F12抗层粘连蛋白β3以及抗层粘连蛋白γ2抗体（20 µg/mL）。
10. 重复步骤1.2–1.3所述的洗涤步骤共三次。
11. 将类球体与30 µL二抗溶液（PBS中含2.5% FBS和1% BSA）在室温下孵育90分钟。所使用的二抗包括：Alexa 488标记的抗兔和抗小鼠二抗（5 µg/mL）。
12. 重复步骤1.2–1.3所述的洗涤步骤共三次。
13. 将类球体与30 µL DAPI染色液在室温下孵育4分钟。
14. 重复步骤1.2–1.3所述的洗涤步骤。
15. 使用玻璃巴斯德吸管将类球体转移至载玻片上的一滴PBS中。
16. 使用激光扫描显微镜以10×放大倍数进行荧光显微成像。在z轴堆栈的不同光学层面（15–20层）获取类球体的多个光学横截面图像。为确定显微镜的激光参数，可先使用不含目标抗原的细胞构成的类球体，或仅用二抗染色的类球体进行调试。所有待比较样本均应使用相同的成像参数。
17. 使用ImageJ软件分析显微图像，方法如先前发表文献所述。步骤总结见图1。以无细胞区域的兴趣区（ROI）的积分信号密度作为背景值。总校正细胞荧光（TCCF）计算公式如下：
    TCCF = 积分信号密度 - （所选类球体面积 × 背景平均荧光强度）
18. 将类球体的总校正荧光（TCF）定义为TCCF相对于类球体面积和堆栈层数的归一化值：
    TCF = 类球体的TCCF / （类球体面积 × 堆栈层数）

结果

图 1. 使用 ImageJ 对类球体中目标蛋白免疫荧光染色进行定量分析的逐步操作流程。 请点击此处查看该图的高清版本。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
4',6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐（DAPI）  	SIGMA-ALDRICH	D9542-10
6F12 抗层粘连蛋白 β3 亚基 小鼠（单克隆） 			实验室自制
牛血清白蛋白 V 型 - BSA  	AppliChem	A1391
Alexa fluor 488 山羊（多克隆）抗小鼠 	Invitrogen	A11029
Alexa fluor 488 山羊（多克隆）抗兔 	Invitrogen	A11034
抗层粘连蛋白 γ2 亚基 小鼠（单克隆） 	Santa Cruz	sc-28330
台式离心机  	Fisher Scientific	50-589-620	Sprout
BM2 抗层粘连蛋白 α3 亚基 小鼠（单克隆） 			由法国里昂 CNRS 的 Patricia Rousselle 教授惠赠
50 mL 离心管	Corning	430290
共聚焦显微镜	Zeiss
DMEM（高糖 4.5 g/L）	Lonza	BE12-604F
人原代胰腺成纤维细胞 	PELOBiotech	PB-H-6201
青霉素/链霉素 	Gibco 	15140-122
显微镜载玻片	Thermo Scientific	J1800AMNZ
多聚甲醛  	Riedel-de Haën	16005
TritonX-100	SIGMA-ALDRICH	X100RS