球体的免疫荧光染色:一种分析球体细胞内和细胞外抗原表达的技术

1. 微球的免疫荧光染色

1. 大约 24 小时后，根据实验条件或每个待分析的蛋白质将球体收集到一个 1.5 mL 反应管中。例如，将用 TGF-β1 刺激的 iNF 的球体放入与未处理的对照 iNF 不同的试管中。为避免由于剪切力过大而导致球体破裂，请切开移液器吸头的末端以扩大孔口。在一个反应管中包括至少 5-10 个球体，以允许重复并考虑洗涤步骤中可能发生的损失。
2. 用台式离心机以 1,000 x g 离心球体约 30-60 秒。通过移液小心地去除含甲基纤维素的上清液，不要干扰沉淀的球体。
3. 用 50 μL 的 1x PBS 洗涤。重复离心步骤，并通过移液小心地去除 PBS，如 1.2 中所述。
4. 根据要染色的蛋白质，在室温下用 50 μL 4% 多聚甲醛的 PBS 溶液固定 20 分钟（对于 αSMA、NG2 和整合素 α3β1）或 50 μL 甲醇在 -20 °C 下固定 10 分钟（对于层粘连蛋白-332 亚基）。
5. 按照步骤 1.2-1.3 中的说明重复洗涤步骤。
6. 在室温下用 0.1% Triton-X 的 PBS 溶液透化细胞 4 分钟。
7. 按照步骤 1.2-1.3 中的说明重复洗涤步骤三次。
8. 将球体在含有 5% FBS 和 2% BSA 的 PBS 中在 RT 下孵育 1 小时，以阻断非特异性蛋白质相互作用位点。
9. 将球体与 30 μL 一抗的 PBS、2.5% FBS 和 1% BSA 溶液在 4 °C 下孵育过夜。使用以下一抗:5 μg/mL 的抗 αSMA Cy-3 偶联抗体和抗 NG2 抗体;BM2 抗层粘连蛋白 α3、6F12 抗层粘连蛋白 β3 和抗层粘连蛋白 γ2 20 μg/mL。
10. 按照步骤 1.2-1.3 中的说明重复洗涤步骤三次。
11. 将球体与 30 μL 二抗在 PBS、2.5% FBS 和 1% BSA 中在 RT 下孵育 90 分钟。使用的二抗如下:Alexa 488 抗兔和抗小鼠 （5 μg/mL）。
12. 按照步骤 1.2-1.3 中的说明重复洗涤步骤三次。
13. 将细胞与 30 μL DAPI 染色溶液在室温下孵育 4 分钟。
14. 按照步骤 1.2-1.3 中的说明重复洗涤步骤。
15. 使用玻璃巴斯德移液管将球体放在载玻片上，滴入一滴 PBS。
16. 在激光扫描显微镜中通过荧光显微镜使用 10 倍的放大倍率对球体进行成像。在 z 堆栈的不同光学平面（15-20 个堆叠平面）上取球体的不同光学横截面。为了在显微镜中建立激光设置，请使用由目标抗原阴性细胞组成的球状体或仅用二抗染色的球状体。对将要比较的所有样本重复使用相同的设置。
17. 如前所述，使用 ImageJ 软件分析显微图像。 图 1 总结了这些步骤。作为背景，确定无细胞感兴趣区域 （ROI） 的积分信号密度。计算总校正细胞荧光 （TCCF） 为:
    TCCF = 积分信号密度 - （所选球体的面积 x 背景的平均荧光）
18. 确定球体的总校正荧光 （TCF），因为 TCCF 归一化为球体面积和堆栈数。
    TCF = 球体的 TCCF / （球体面积 x 堆栈数）

图 1.使用 ImageJ 定量球状体中目标蛋白质的免疫荧光染色的连续步骤。请点击这里查看此图的较大版本。