不可逆电穿孔：一种用于小鼠胰腺肿瘤消融的技术

摘要

来源：Shankara Narayanan, J. S.，等。用于研究不可逆电穿孔效应的同源性胰腺癌小鼠模型。J. Vis. Exp. (2018)。

本视频介绍了在小鼠中对胰腺肿瘤进行不可逆电穿孔（IRE）以实现非热消融的操作步骤。在高度可控的条件下，可成功对皮下（SQ）和原位肿瘤实施IRE治疗，从而为术后各类研究提供便利。

方案

所有涉及动物模型的实验程序均已通过当地机构动物护理委员会和JoVE兽医审查委员会的审核。

1. SQ 肿瘤的不可逆电穿孔治疗

1. 准备所需材料：方波电穿孔仪、安全脚踏开关、电极（阵列针式电极与镊式电极）及适配器。同时准备好无菌缝线（不可吸收4-0）、酒精棉片、毛发剪、脱毛膏、眼用润滑剂、棉纱布、丁丙诺啡及麻醉剂。
2. 使用气体灭菌法对镊子或针阵列电极进行灭菌。不建议使用高压蒸汽灭菌。在不同动物之间使用玻璃珠灭菌器对电极进行灭菌。
3. 当皮下肿瘤移植体直径达到5 mm时，按以下步骤成功诱导小鼠麻醉。简要而言，在手术前30分钟，皮下注射0.05–1 mg/kg的布托啡诺镇痛剂至受体小鼠。随后，使用精密挥发器（或其他麻醉剂）以2 L/min的氧气流速输送2–3%异氟烷对受体小鼠进行麻醉。整个操作过程中，将小鼠置于37 °C加热垫上。在眼睛上涂抹润滑剂以防止角膜干燥。通过无惊跳反射初步判断麻醉深度，并通过轻捏脚趾无足底反射确认达到外科手术麻醉平面。在整个手术过程中维持麻醉状态。
4. 将麻醉后的小鼠侧卧放置，以接触其侧腹部的皮下肿瘤。使用剃毛器去除毛发，并用酒精棉片清洁皮肤。
5. 对于SQ肿瘤，使用双针阵列电极。用镊子提起肿瘤部位正下方的皮肤，将电极平行于身体方向经皮插入，注意勿穿透腹膜腔。电极穿过皮肤后，应调整其位置，使其位于肿瘤两侧并形成夹持状。
6. 将电穿孔仪设置为在1,500 V/cm的电场强度下，以1 Hz的频率输送100 µs的脉冲，共150个脉冲。使用脚踏开关触发脉冲。每10个脉冲为一组，组间间隔10 s，以利于散热并确认电极位置正确。
   注意： 如果不使用麻痹剂，小鼠在进行不可逆电穿孔（IRE）时会出现肌肉收缩，可能导致电极移位，除非手动固定。
7. 在完成给药后移除电极，总时间不应超过200秒。记录电穿孔仪上显示的实际输出电压。将小鼠放回其饲养笼中，自由获取食物和水，以完成不可逆电穿孔（IRE）后的恢复。将笼子置于加热垫上以促进恢复。监测呼吸、灌注等生命体征 等等， 在恢复过程中，确认小鼠苏醒后出现翻正反射，然后将鼠笼放回常规饲养环境。术后8至12小时给予布托啡诺0.05–0.1 mg/kg，并根据疼痛表现，此后每8至12小时给药一次，必要时使用。

2. 原位肿瘤的不可逆电穿孔治疗

注意：原位肿瘤的不可逆电穿孔治疗涉及对同一只小鼠进行第二次存活手术，因此在开始前需获得当地IACUC的特殊批准。

1. 准备所需材料：将手术器械（如剪刀、手术刀、持针器、尖头镊子和平头镊子）进行高压灭菌。同时将以下物品置于附近：无菌缝合线（可吸收6-0和不可吸收4-0）、酒精棉片、毛发剪、脱毛膏、眼用润滑剂、棉纱布、10%聚维酮碘溶液、手术铺巾、加热垫、方波电穿孔仪、安全脚踏开关、电极及其适配器、布托啡诺和麻醉剂。
2. 通过原位肿瘤生长情况评估小鼠 体内 生物发光成像。在原位移植后的第4天开始进行成像，以监测肿瘤生长情况，每周成像两次。成像当天，在成像前10分钟，通过腹腔注射向已麻醉（2–3%异氟烷，氧气流速2 L/min）的受体小鼠注射30 mg/kg的D-荧光素。使用具备无自发荧光加热载物台的生物发光成像仪，在维持小鼠麻醉状态下，以无发射滤光片的发光模式进行荧光素酶活性成像，曝光时间至少5秒。
   注意： 原位肿瘤在植入后8至10天最适合进行不可逆电穿孔（IRE）治疗，此时肿瘤在荧光素酶发光成像中清晰可见，且仍局限于胰腺内
3. 按照以下步骤定位移植的肿瘤。简要而言，在手术前30分钟，皮下注射0.05–1 mg/kg的布托啡诺镇痛剂至受体小鼠。使用精密挥发器（或其他麻醉剂）以2–3%异氟烷（氧气流速2 L/min）对受体小鼠进行麻醉。整个操作过程中，将小鼠置于37 °C加热垫上。在小鼠眼部涂抹润滑剂以防止角膜干燥。通过观察是否缺乏惊跳反射初步判断麻醉深度，并通过轻捏脚趾无足底反射确认达到外科手术麻醉平面。在整个手术过程中维持麻醉状态。将小鼠仰卧放置，然后轻轻翻转至右侧卧位，使左侧腹部暴露。使用脱毛膏去除小鼠腹部毛发，并用纱布擦拭干净，确保切口后无游离毛发进入腹腔。用10%聚维酮碘溶液和酒精棉片交替擦拭左侧腹部皮肤，重复3个循环，完成术前消毒。使用无菌手术刀在腹中线左侧1 cm、肋缘下方、略偏脾脏内侧处，做一长度为1.5 cm的横向或斜向皮肤切口。随后，沿表层切口方向切开腹壁肌肉层。使用平头镊子找到脾脏，并轻柔地将其从腹腔内牵出。用无菌棉签牵开脾脏，找到附着于脾脏底部的胰腺尾部。使用平头镊子将胰腺尾部向侧方牵拉。若肿瘤不易定位，可使用钝头镊子轻柔移动胃和脾脏以辨认肿瘤位置。
4. 用钝头镊子将肿瘤外置，并用镊式电极的铂金电极紧密夹住肿瘤。按照步骤1.7中预设的程序，使用方波电穿孔仪，通过脚踏开关控制，以每组10次脉冲的形式递送电穿孔脉冲。
5. IRE 后至少将肿瘤外置 60 秒，以监测是否有出血迹象。随后将肿瘤复位至腹腔，并按前述方法关闭切口。简要而言，使用 6-0 可吸收缝线采用连续或间断缝合关闭腹肌层，使用 3-0 至 6-0 不可吸收缝线间断缝合皮肤。此时停止麻醉。按照 1.7 步骤所述让小鼠恢复。  监测小鼠直至其恢复。
6. 使用IRE对肿瘤生长影响的监测 体内 按照第2.2步进行荧光素酶成像

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
ECM 830 方波电穿孔仪	哈佛仪器公司	BTX # 45-0002 (58018-004)
2针阵列电极	哈佛仪器	45-0167
安全脚踏开关	哈佛仪器公司	45-0211
铂金镊子电极	哈佛仪器公司	45-0486
异氟烷	Sigma-Aldrich公司	792632
Lacrilube	Fisher Scientific	19090646
布托啡诺	Fisher Scientific	NC1292810
D-荧光素	Perkin Elmer	122799
IVIS Spectrum 活体成像系统	Perkin Elmer	124262
小鼠品系 C57BL/6J	杰克逊实验室	000664/Black 6
BD Precisionglide 注射器针头	Sigma-Aldrich公司	Z192406
酒精棉片（70%异丙醇）	BD	326895
一次性无菌手术刀	VWR	21909
棉签	VWR	89198
缝合针，45 厘米，6-0 规格	哈佛仪器	72-3308
缝合针，45 厘米，4-0 规格	哈佛仪器公司	72-3314
聚维酮碘 10%	BD	29900-404
一次性暖贴	KENT SCIENTIFIC CORP	TP-3E
小鼠毛发剪	KENT SCIENTIFIC CORP	CL8787
手术铺巾	哈佛仪器公司	59-7421