磁驱动生物打印三维球体共培养：一种癌细胞与成纤维细胞共培养方法

摘要

来源：Noel P. 等 胰腺癌细胞与成纤维细胞三维球体共培养物的制备及代谢分析。 J. Vis. Exp. (2017)

本视频介绍了共培养的胰腺癌细胞和成纤维细胞的三维磁性生物打印技术。在磁场作用下，利用生物相容性纳米颗粒组装体对胰腺癌细胞和活化的胰腺成纤维细胞进行共培养并磁化，从而生成球状体。

方案

1. 使用磁性生物打印技术培养胰腺癌三维球体

1. 采用标准的无菌组织培养技术，将目标细胞在含有适当生长培养基的T75培养瓶中培养至70-80%汇合度。
   注意： 通常从一个70-80%汇合度的T75培养瓶中收获5-7 × 10⁶ 个细胞。本研究使用了两种不同的细胞类型——Patu8902（胰腺肿瘤细胞）和PS1细胞（活化的胰腺星状细胞）。两种细胞系均在添加了10%（v/v）胎牛血清（FBS）和1×青霉素-链霉素（p/s）的Roswell Park Memorial Institute 1640培养基（RPMI-1640）中培养。
2. 用5 mL杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）洗涤细胞一次。
3. 在37 °C条件下，加入2 mL 0.05%胰蛋白酶-EDTA消化5-10分钟，使细胞从塑料表面脱落。在显微镜下观察细胞脱落情况。
4. 向已脱落的细胞中加入8 mL生长培养基以终止胰蛋白酶活性。避免过度消化，以免对细胞的健康状态和存活率产生不利影响。
5. 用移液器反复吹打细胞以形成单细胞悬液，并使用自动细胞计数仪或血细胞计数板测定细胞密度。
6. 同时，将一管NS试剂平衡至室温。
7. 根据所需接种的类球体（孔）数量计算所需细胞量，并分装至新的15 mL锥形离心管中。例如，若要在96孔板的每个孔中接种5,000个细胞，则需分装至少5.5 × 10⁵ 个细胞。
8. 以500 × g离心3分钟收集细胞。小心吸除或倾倒上清液，并用生长培养基将细胞重悬至1.0 × 10⁶ 个细胞/mL的浓度。使用宽口移液枪头轻柔吹打，避免剪切损伤。例如，将5.5 × 10⁵ 个细胞重悬于550 µL生长培养基中。
9. 使用已平衡至室温的NS试剂对所需数量的细胞进行磁化（见步骤1.6）。
   1. 直接将NS试剂加入含细胞的生长培养基悬液中，并轻柔混匀。为实现高效的磁性标记，每100 µL细胞悬液（浓度为1 × 10⁶ 个细胞/mL）使用10 µL NS试剂。
      注意： 在典型实验中，将550 µL中的5.5×10⁵ 个Patu8902细胞与55 µL NS试剂混合标记；将1100 µL中的1.1×10⁶ 个PS1细胞与110 µL NS试剂分别混合标记。
   2. 轻轻颠倒离心管数次以确保细胞充分混悬。暂时将细胞-NS混合物转移至24孔板中的单个孔内。每种待磁化的细胞类型应分别处理。盖上盖子后，在室温下轻轻振荡孵育2小时，使NS试剂结合到细胞表面。
      注意： 在独立实验中，已成功利用该方法分别从单独的Patu8902或PS1细胞起始培养类球体，以及在打印前预先混合两种细胞类型后形成的共培养类球体。后续步骤将描述由Patu8902和PS2细胞生成共培养类球体的方法。
10. 轻柔地反复吹打磁化后的细胞以充分混匀，并配制含有目标细胞数量的母液。接种类球体时，每孔共使用15,000个细胞（5,000个Patu8902 + 10,000个PS1），调整总体积至每孔150 µL（96孔板）。
    注意： 无论使用的细胞数量如何，最终加入每孔的体积必须保持一致。
11. 将防细胞黏附的96孔板置于96孔磁力类球体驱动装置上方，并向每孔加入150 µL细胞混合液。观察细胞在磁体上方逐渐聚集至孔中央。盖上盖子后，将整个装置在37 °C、5% CO₂ 的培养箱中过夜孵育，期间保持磁力驱动装置连接。随后移除磁力驱动装置，继续孵育培养最多7天。
    注意： 使用磁力类球体驱动装置进行类球体打印时，必须使用防细胞黏附的培养板。请确保使用配备较薄较小磁体的类球体驱动装置，而非固定用驱动装置。
12. 每天监测类球体的生长情况。每三天更换一次新鲜生长培养基：将安装在磁力固定装置上的培养板倾斜，使用多通道移液器吸出旧培养基。
    注意： Patu8902和PS1细胞以每孔15,000个细胞共接种后，可在5-7天内生长为直径400-600 µm的三维类球体。此时类球体可用于代谢表征、药物评价及其他下游应用。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.05% 胰蛋白酶 EDTA	Sigma	25300-054
96 孔防细胞贴壁培养板	USA Scientific/ Griener Bio-One	655970	类球体生长板
Cellometry 细胞计数载玻片	Nexcelom	CHT4-SD100-002
n3D 磁性类球体驱动装置	Nano3D Bioscience	655841	类球体生物打印试剂盒的组成部分
n3D 磁性类球体固定 装置	Nano3D Bioscience	655841	类球体生物打印试剂盒的组成部分
n3D NanoShuttle-PL	Nano3D Bioscience	655841	类球体生物打印试剂盒的组成部分： 4 °C 保存
Patu8902 细胞	实验室库存		胰管腺癌 细胞
PS1 细胞	实验室库存		活化的胰腺星状细胞
RPMI1640	Gibco	11875-093	细胞和类球体的生长培养基