三维球状体中的细胞外通量检测：一种测量胰腺肿瘤球状体代谢活性的方法

来源：Noel, P., 等. 胰腺癌细胞与成纤维细胞三维球体共培养物的制备及代谢分析. J. Vis. Exp. (2017).

本方案描述了对由胰腺癌细胞（Patu8902）与活化的胰腺成纤维细胞（PS1）共培养生成的三维球状体进行细胞外通量检测的技术，用于测量两种主要的能量生成途径——糖酵解和线粒体呼吸作用。

1. 使用细胞外通量分析仪对三维胰腺肿瘤类球体进行生物能量代谢通路的代谢检测

注意：本节描述了使用专为3D球状体设计的检测微孔板和细胞外通量分析仪来分析球状体代谢功能的方法。

类球体从生长培养板向类球体检测微孔板的洗涤与转移
注意： 当类球体直径达到约500时，可用于代谢分析 µm
1. 实验前一天，使用分析校准液（200 μL）水合探针或传感器 cartridge µ每孔加入适量液体（L/孔）至提供的工具板中，在湿润的培养箱中孵育过夜（4–18 小时）（非 CO₂ 培养箱）₂) 设置为 37 °C.
2. 根据所需的代谢检测，通过向基础培养基（见材料表）中添加以下成分来配制相应的检测培养基：进行糖酵解压力测试（GST）时添加 2 mM L-谷氨酰胺；进行线粒体压力测试（MST）时添加 1 mM 丙酮酸、2 mM L-谷氨酰胺和 10 mM 葡萄糖。
  注意： 细胞外通量分析仪可测量96孔板中活细胞的线粒体呼吸（OCR）和糖酵解（ECAR）。这些速率可提供受检样本中细胞代谢功能的总体情况。具体操作步骤请参阅检测试剂盒中的说明书。
3. 添加检测特异性补充剂（参见步骤1.1.1）后，将含补充剂的检测培养基在37°C 水浴并调节 pH 至 7.4 ± 0.1，用0.1N NaOH调节。使用前保持培养基温暖。
4. 将检测试剂盒试剂在校准的检测培养基中重悬至推荐的储备浓度。
  注意： 这些在10处制备× 所需的最终孔内浓度。葡萄糖、寡霉素和2-脱氧葡萄糖（2-DG）的储备液浓度分别为100 mM、100 µ分别为 M 和 500 mM。
5. 在光学显微镜下观察生长板中的类球体，检查其形态及整体均一性，包括类球体的形状和结构。
6. 将生长板转移至磁力固定驱动装置上，并小心吸除约120 µL 培养基。用约 120 μL 培养基轻柔洗涤类球体 µ加入预热并预先校准的1 L检测培养基，吸除后重复洗涤两次。再次在显微镜下检查类球体，确保类球体未被洗脱。
7. 通过向球状体检测微孔板中加入180 μL µ将预热的培养基加入每个孔中。
8. 将P20移液器调至10 µL 并安装一个宽口吸头。如果无现成的宽口吸头，可用干净的剪刀或手术刀片将普通移液器吸头的尖端剪掉，以扩大孔径。
  注意： 这将减少剪切力，同时在将类球体转移至检测板时保持其整体形态。
9. 使用预热（37℃）的°C) 表面以进行类球体的转移。使用经白光灯加热的X射线片观察仪表面，以增强对比度，便于在转移过程中观察类球体。
10. 使用配有宽孔吸头的P20微量移液器，小心地从细胞防粘培养板中吸取单个预清洗的类球体，并轻柔地将类球体直接转移至类球体检测板每个孔的中心，用于进行代谢检测。让每个类球体仅依靠重力自然沉降至各孔的中央微腔室中，以完成检测板的加样。
  注意： 每个球体通常需要5-8秒通过重力作用落入孔的中心位置。在球体未完全沉降至微腔底部前，请勿拔出移液枪。请勿将球体接种至检测板的4个角落孔（A1、A12、H1、H12），这些孔将用作背景对照孔。
11. 监测每个球状体的形态和位置，以确保每个球状体位于各孔的中央。如有必要，使用宽孔移液吸头将球状体吸出，并通过重力沉降重新将其置于孔中央。
12. 待所有类球体转移完毕后，将检测板放入37 °C 湿润空气培养箱（非 CO₂）₂在检测前孵育一小时。
使用化合物加载传感器 cartridge 并执行检测
1. 准备10× 在步骤1.1.2中所述的特定检测培养基中配制浓缩的检测特异性试剂。例如，进行GST检测时，将葡萄糖、寡霉素和2-DG按照检测说明书推荐的体积进行重悬。GST和MST检测均使用Patu8902-PS1类球体进行。
2. 将传感器盒正确放置，使标有 A-H 行的一侧位于左侧，然后将加样导板置于传感器盒上方。为确保目标孔位正确加样，请调整加样导板方向，使对应待加样孔位的字母位于左上角。
3. 使用多通道移液器将试剂直接加入进样口。在整个操作过程中，用手指尖固定加样导板的位置。
  注意： 每种试剂应按照检测说明书推荐的加样孔加入。加样时应避免产生气泡，但切勿敲击芯片的任何部位以去除气泡。
4. 取下加载导板，将其置于与卡盒齐平的视线高度，目视检查加样孔的加载是否均匀。
5. 使用仪器控制器Wave软件（以下简称分析软件）创建实验检测设计/仪器操作程序，具体步骤如第1.3节所述。
使用分析软件进行检测设计与实施
1. 为实验创建一个检测模板
  1. 打开分析软件并点击 "模板" 或从现有的检测模板中选择。双击 "空白模板".
  2. 定义实验组和实验条件。
    1. 定义 A、B 和 C 端口的注射策略，D 端口保持空置。
      注意： 对于GST检测，仅这些孔将加入葡萄糖、寡霉素和2-DG。对于MST检测，则加入寡霉素、FCCP和鱼藤酮。
    2. 若类球体经一种或多种测试化合物预处理，并设有对照组，需明确说明预处理条件。需明确说明检测培养基的来源、添加物及其他相关信息。
    3. 定义一种或多种细胞类型（例如 Patu8902、PS1），并查看其密度和传代次数信息。
  3. 点击 "生成分组".
  4. 点击 "孔板布局图" 标签并根据实验设计为检测板分配分组。
  5. 选择四个角上的孔作为背景孔，确保这些孔中无类球体存在。
在分析仪上运行检测
1. 单击仪器方案标签页。通过勾选保留默认的仪器方案命令 "校准", "平衡" 和 "基线测量周期".
2. 点击 "注射" 并为每个通道定义化合物。将类球体的测量循环次数从默认的3次修改为6次。保持默认的3分钟混匀、0分钟等待和3分钟测量时间。
  注意： 默认的混合-等待-测量时间分别为3分钟、0分钟、3分钟。通常在加入第一种检测化合物之前，需进行三次基础速率测量。根据实验设计，这些测量值可进行校准和重新调整。
3. 审查方案与小组摘要。
4. 保存检测设计模板。
5. 在注射端口已加载检测底物后，进行检测前校准。将带有辅助板的 cartridge 转移至细胞外通量分析仪。
  注意： 这通常在15-20分钟内完成，用于校准传感器以进行OCR和ECAR测量。
6. 校准微孔板后，将工具板替换为含有3D球状体的预热检测板，并启动检测。测量完成后，将数据导出至电子表格、绘图或统计分析软件中进行数据分析。

姓名	公司	目录编号	评论
96孔防细胞黏附板	USA Scientific/ Griener Bio-One	655970	类球体生长板
D-葡萄糖	Sigma	D9434
DPBS	Gibco	14190-144
糖酵解应激检测试剂盒	Agilent Technologies	103020-100
L-谷氨酰胺	Sigma	59202C
线粒体应激检测试剂盒	Agilent Technologies	103015-100
Patu8902细胞	实验室库存		胰管腺癌细胞
PS1细胞	实验室库存		活化的胰腺星状细胞
RPMI1640	Gibco	11875-093	细胞及类球体的生长培养基
Seahorse XFe 96 细胞外通量分析仪	Agilent Technologies		细胞外通量分析仪
丙酮酸钠	Sigma	S8636
XF基础培养基	Agilent Technologies	102365-100	XFe 96代谢检测用基础培养基

三维球状体中的细胞外通量检测：一种测量胰腺肿瘤球状体代谢活性的方法

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