胰腺导管腺癌干细胞分离：一种从胰腺肿瘤中分离癌症干细胞的方法

摘要

来源：Lonardo, E.，等。研究胰腺癌干细胞特性以开发新的治疗策略。J. Vis. Exp. (2015)。

本文介绍了从人胰腺导管腺癌（PDAC）组织中分离胰腺癌干细胞（CSCs）的技术。这些CSCs用于研究药物处理对肿瘤功能影响的实验研究 体外 CSCs的自我更新能力在开发更高效癌症治疗策略中的作用。

方案

1. 从人胰腺导管腺癌中分离 CSCs （图 1）

1. 在无菌生物安全柜中，将人胰腺导管腺癌（PDAC）组织转移至含有1 ml无菌1×磷酸盐缓冲液（PBS）的60 × 15 mm培养皿中。使用无菌手术刀和镊子将肿瘤组织切成小块（1–5 mm）。
2. 向培养皿中加入1 ml无菌1×PBS，重复吹打操作，直至组织完全解离，通常需要3–4轮。将组织悬液（用1×PBS补至终体积5 ml）转移至无菌离心管中，并使用组织解离仪（如gentleMACS）进行机械匀浆。
3. 将匀浆后的组织在37°C下与胶原酶（使用含2.5 mg/ml胶原酶的1×PBS）孵育60分钟，随后在900 × g下离心5分钟。弃去上清液，将细胞沉淀重悬于10 ml完全培养基中。将细胞悬液通过40 µm细胞筛过滤，再在900 × g下离心5分钟。
4. 弃去上清液，将沉淀用5 ml红细胞裂解缓冲液（氯化铵-氯化钾，ACK）重悬，并孵育
5. 将沉淀重悬于肿瘤干细胞（CSCs）培养基中，接种于明胶包被的培养皿，37°C孵育1小时。此步骤可去除大部分快速贴壁的成纤维细胞。
6. 从孵育箱中取出培养皿，小心收集细胞悬液，并使用血细胞计数板对活细胞（台盼蓝阴性）数量进行定量。为此，轻轻混匀悬液，吸取20 µl悬液转移至Eppendorf管中。向微量离心管中的细胞加入20 µl（1:1比例）台盼蓝染液，充分混匀。取约10 µl混合液滴加至血细胞计数板上。
7. 计数计数室四个角象限内的所有透明细胞，以获得活细胞数。
   注意： 不同样本间细胞的活力和得率可能存在显著差异。PDAC样本的细胞活力通常在45–70%之间，直径为3–5 mm的宏观肿瘤组织块可获得约5×10⁶个活细胞。

结果

图1. 二甲双胍选择性靶向肿瘤干细胞（CSCs）。
（A）二甲双胍减小了细胞球的大小。右侧图显示胰腺癌细胞经指定浓度二甲双胍处理7天后形成的细胞球代表性图像。左侧图为细胞球大小的定量分析（n≥6），横坐标所示数字代表不同来源的肿瘤样本。（B）在有或无二甲双胍存在下培养7天后的细胞球形成能力（n≥6），横坐标所示数字代表不同来源的肿瘤样本。（C）胰腺癌原代细胞在继代和再继代细胞球中肿瘤干细胞自我更新能力的代表性图示。处理仅在第一代细胞球形成期间进行，共持续7天（n = 6）。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
计数室/<br/> 血细胞计数板&nbsp;	Hausser Scientific Co	3200
用于增殖和活力检测的CASY细胞计数与分析仪	Roche Innovatis	AG CASY Model TTC 45,60,150 &mu;m
GentleMACS组织解离器	Miltenyi Co	130-093-235
GentleMACS C管	Miltenyi Co	130-093-237
100 mm细胞培养皿	BD Falcon	353803
细胞筛	BD Falcon	352350
15 ml聚丙烯圆锥形离心管	BD Falcon	352097
50 ml聚丙烯圆锥形离心管	BD Falcon	352070
1.5 ml无菌离心管	Eppendorf	0030 120.086
50 ml离心管	Corning	430828
无菌培养皿，直径10 cm	Corning	353003
IV型胶原酶	Stem Cell Technologies	7909
RPMI 1640培养基	Life technologies	11875-085
青霉素/链霉素溶液，100倍浓缩	Life technologies	SV30010
L-谷氨酰胺，200 mM，100倍浓缩	Life technologies	25030-081
B27添加剂，50倍浓缩	Life technologies	17504-044
碱性成纤维细胞生长因子	Sigma	F0291
Dulbecco&rsquo;s改良Eagle培养基/F12	Sigma	D8437
无菌1倍Dulbecco&rsquo;s磷酸盐缓冲液	Sigma	D8537
台盼蓝	Life technologies	15250-061
带CO<sub>2</sub>输入的培养箱
显微剪刀
弯头镊子
细尖镊子