球体形成检测:一种识别胰腺癌干细胞和筛选疗法的体外方法

1.球体形成测定和分析

1. 球体形成测定和二甲双胍治疗
   1. 取所需数量的细胞，并加入适当体积的 CSCs 培养基，以制备 2,000 个细胞/ml 的细胞浓度。不要将细胞悬液在冰上放置不超过 1 小时，并在电镀前充分混合。
   2. 向 24 孔板的第一行和最后一行添加 500 μl 1X PBS 进行加湿，以帮助最大限度地减少培养基蒸发。将细胞以每孔 2,000 个细胞的密度接种到 1 ml 肿瘤球培养基（2,000 个细胞/ml）中的超低附着细胞板中><。 注意:用于肿瘤球形成测定的细胞数量可能因肿瘤类型而异。
   3. 用载体（阴性对照）处理至少 4 个孔，每个分配的处理处理 4 个孔，例如，3 mM 二甲双胍。将细胞置于设定为 37 °C 的培养箱中，并向细胞提供 5% CO₂ 一周。
      注意:不应更改培养基以允许肿瘤球体不受干扰地形成，但可以每天补充生长因子，因为它们在培养基中不稳定。
   4. 每隔一天添加处理，例如，向每个孔中加入 3 mM 二甲双胍或载体。通过使用允许计数较大结构的自动细胞计数器，评估 5 天和/或 7 天后形成的肿瘤球的数量（图 1><）。 注意:只应考虑至少 40 μm 的肿瘤球体，并且可以分别分为小 （40 - 80 μm） 或大 （80 - 120 μm）。结果可以表示为肿瘤球的百分比除以接种的初始细胞数（例如，2,000 个细胞）。
2. 第一代肿瘤球的连续传代
   1. 孵育 7 天后，使用 40 μm 细胞过滤器收获肿瘤球，并在 RT 下以 900 x g 离心 5 分钟。
   2. 使用胰蛋白酶将肿瘤球的沉淀解离成单细胞，然后再次扩增获得的单细胞细胞悬液 7 天。

图 1.二甲双胍治疗可抑制耗氧量并诱导 ROS 产生。（A） 二甲双胍还可抑制球源细胞的耗氧量 （OCR）。用二甲双胍处理两个不同的 PDAC 次级球体，并通过细胞外通量分析测量 OCR 变化。鱼藤酮注射液用作线粒体 OCR 总消耗量的对照。X 轴表示以 pmol 为单位的耗氧率，即氧气/小时，由每个孔中的蛋白质含量标准化。（B） 用二甲双胍处理 A 中使用的 PDAC 球体 8 小时，并使用羧基 DCFDA 通过流式细胞术评估 ROS 的产生。左图，代表性流式细胞术图。右图是三个独立实验的数据摘要。请点击这里查看此图的较大版本。