球体形成实验：一种用于鉴定胰腺癌干细胞及筛选治疗方案的体外方法

摘要

来源：Lonardo, E. 等. 研究胰腺癌干细胞特性以开发新的治疗策略. J. Vis. Exp.(2015).

本视频展示了胰腺癌干细胞球体的培养方案 体外该检测可作为筛选潜在靶向肿瘤干细胞化合物的工具。

方案

1.成球实验与分析

1. 成球实验与二甲双胍处理
   1. 取所需数量的细胞，加入适量的肿瘤干细胞培养基，制备成浓度为 2,000 个细胞/ml 的细胞悬液。细胞悬液置于冰上不得超过 1 小时，接种前需充分混匀。
   2. 在 24 孔板的第一行和最后一行各加入 500 µl 的 1×PBS 以保持湿度，从而减少培养基蒸发。将细胞以每孔 2,000 个细胞（1 ml 肿瘤成球培养基）的密度接种至超低吸附细胞培养板中。
      ​注意：不同肿瘤类型在进行成球实验时所使用的细胞数量可能有所不同。
   3. 至少设 4 个孔为溶剂对照组（阴性对照），4 个孔为每种指定处理组，例如，3 mM 二甲双胍。将细胞置于 37 °C 培养箱中，并提供 5% CO₂，培养一周。
      注意：为避免干扰肿瘤球的形成，期间不应更换培养基，但可每日补充生长因子，因其在培养基中不稳定。
   4. 每隔一天向各孔添加处理物，例如，3 mM 二甲双胍或溶剂对照。在培养第 5 天和/或第 7 天，使用可计数较大结构的自动细胞计数仪评估所形成的肿瘤球数量（图 1）。
      注意：仅计数直径不小于 40 µm 的肿瘤球，并可根据大小分为小球（40–80 µm）和大球（80–120 µm）。结果可表示为形成的肿瘤球数量占初始接种细胞数（例如，2,000 个细胞）的百分比。
2. 第一代肿瘤球的连续传代
   1. 培养 7 天后，使用 40 µm 细胞滤网收集肿瘤球，并在室温下以 900 × g 离心 5 分钟。
   2. 用胰蛋白酶将肿瘤球沉淀消化为单细胞，随后将获得的单细胞悬液再次扩增培养 7 天。

结果

图 1. 二甲双胍处理抑制耗氧并诱导活性氧生成。 （A）添加二甲双胍可抑制球体来源细胞的耗氧率（OCR）。两种不同的胰腺导管腺癌（PDAC）继代球体经二甲双胍处理后，通过细胞外通量分析检测OCR变化。使用鱼藤酮注射作为线粒体总OCR的对照。横轴表示每小时每孔蛋白含量标准化后的耗氧速率，单位为pmol氧气/hr。 （B）在A中使用的PDAC球体经二甲双胍处理8小时后，采用羧基-DCFDA通过流式细胞术检测活性氧（ROS）的生成。左侧为代表性流式细胞术图谱；右侧为三次独立实验的数据汇总。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
24孔超低吸附培养板	康宁	3474
无菌 1x DMEM’磷酸盐缓冲液	Sigma	D8537
二甲双胍	Sigma	D150959-5G
0.05% 胰蛋白酶溶液	生命技术公司	25300054
CO₂培养箱<sub>2</sub> 输入
CASY 细胞计数仪和分析仪用于细胞增殖与活力检测	罗氏 Innovatis	AG CASY Model TTC 45,60,150 &mu;m
血细胞计数板/血球计数器	豪泽科学公司	3200
50 ml 离心管	康宁	430828
15 毫升聚丙烯锥形管	BD Falcon	352097
50 ml 聚丙烯锥形管	BD Falcon	352070