基于翻译后修饰的肿瘤微环境监测：一种利用肿瘤类球体追踪细胞外基质刚性变化的方法

摘要

来源：Jones, D. P., 等. 利用粒子追踪微流变学在三维肿瘤模型中进行细胞外基质刚度的纵向测量. J. Vis. Exp. (2014)。

本方案描述了一种利用粒子追踪微流变学（PTM）监测细胞外基质刚度变化的技术。该方法通过将三维胰腺肿瘤类球体培养在含有嵌入式荧光探针的细胞外基质中，进行视频粒子追踪与分析。

方案

1. 制备嵌入细胞外基质的三维肿瘤球

1. 在超净工作台内准备一个配备所需材料的工作站。
2. 通过将2份储备探针（2%固体含量）加入25份无菌水中，配制羧基化修饰的1 μm直径荧光示踪探针的稀释混合液。
3. 从冰箱中取出一瓶3.1 mg/ml的牛胶原蛋白，并置于冰上。
4. 将125 μl胶原蛋白分装至一个空的2 ml小瓶中。
5. 向含有胶原蛋白的小瓶中加入50 μl稀释后的示踪探针溶液，短暂涡旋以混匀探针。
6. 加入235 μl含酚红的适当细胞培养基（溶液将变为黄色），使总体积达到410 μl，短暂涡旋混匀后，取出205 μl（总体积的一半）转移至一个新的2 ml小瓶中。小瓶1将用于含肿瘤类球体的实验，小瓶2作为对照混合液。
7. 向小瓶1中加入约2 μl的1 M NaOH，使溶液恢复至中性pH值（含酚红的培养基应恢复为红色）。注意：若未保持在冰上，此操作将导致混合物开始凝固。短暂涡旋混匀后，立即放回冰架上。
   注意： 肿瘤类球体在培养9天后肉眼几乎不可见，从琼脂糖基质中取出是一项精细操作。部分使用者可借助解剖显微镜辅助操作。在转移过程中维持类球体的完整性至关重要。
8. 使用宽口移液器吸头，轻轻从含有肿瘤类球体的孔中移除40 μl培养基。在进行下一步操作时保留此40 μl液体。
9. 检查孔中是否已将类球体移出。若已移出，将含有类球体的40 μl液体加入小瓶1中；若未移出，则将40 μl液体重新放回孔中，并重复上一步操作。
10. 轻轻搅动小瓶1（避免涡旋，以免损伤类球体），然后将混合物以每份60 μl分装至96孔板的三个独立孔中。加样后使用显微镜检查每个孔，以确定哪个孔含有类球体。
11. 向小瓶2中加入约2 μl的1 M NaOH和40 μl细胞培养基，涡旋混匀后，取60 μl该混合液加入96孔板中的一个空孔，并标记为对照孔。
12. 将96孔板放入37 °C培养箱中，孵育至少1小时以完成凝固。

2. 构建样本点网格并在每个点采集视频

1. 将样本板从培养箱转移至显微镜载物台上。若无加热载物台，需静置10分钟，使样本与室温平衡。
2. 使用低倍物镜观察样本，确认其结构完整且适合成像。确定肿瘤在孔内的位置。
3. 决定采集的采样点数量。通常在每个孔内围绕类球体设置20个采样点，并分布于同心圆环上，可获得足够详细的成像结果。
4. 移动载物台至每个目标位置，使用显微镜配套软件记录x和y坐标（若无配套软件，可手动记录坐标）。
5. 切换至高倍物镜（通常为100倍），并根据示踪探针的激发波长选择合适的滤光片组。利用步骤2.4中建立的点位列表，移动至网格中的第一个点。
6. 调节焦距以找到孔底，然后向上调节，找到包含多个清晰聚焦示踪探针的视野（fov）。
7. 观察强度直方图，调整曝光强度和时间，以获得尽可能大的动态范围，同时确保图像不发生饱和。
8. 以每帧20-30毫秒的帧率采集视频序列（建议采集约800帧，或时长16-24秒，以在获得足够统计学稳健的均方位移计算结果与最小化每个空间网格点的采集时间之间取得平衡），并按照适当的命名规范保存。录制过程中请勿触碰显微镜或实验台。
9. 对网格中的每个采样点重复执行步骤2.6至2.9。
10. 对实验中每个孔重复执行步骤2.3至2.10。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
牛I型胶原蛋白	BD Biosciences, San Jose, CA	354231
PANC-1	美国典型培养物保藏中心, Manassas, VA	CRL1469	或其他合适的细胞类型
荧光微球	Life Technologies, Carlsbad, CA	906906
琼脂糖	Fisher Bioreagents, Waltham, MA	C12H18O9
NaOH	Fisher Bioreagents, Waltham, MA	NC0480985
96孔成像板	Corning Inc., Corning, NY	3904
DMEM	Hyclone, Waltham, MA	SH30243.01	或合适的细胞培养基
蔡司AxioObsever显微镜	Zeiss, Oberkochen, Germany		包含高速相机和成像软件