评估DNA损伤灶：利用免疫荧光染色法鉴定癌细胞系中辐射诱导的DNA损伤灶

摘要

来源：Maliszewska-Olejniczak 等。人结肠癌细胞中DNA损伤与修复焦点的免疫荧光成像。J. Vis. Exp. (2020)。

本视频介绍了一种利用免疫荧光染色法在结肠癌细胞系中检测辐射诱导的DNA修复灶的实验方案。DNA修复蛋白会在DNA损伤位点被激活；因此，我们可以使用特异性抗体对其进行检测，并在荧光显微镜下观察其定位。

方案

1. 细胞培养的准备与实验设置

1. 按照供应商建议，在含有10 mL配制的McCoy's 5a改良培养基（补充10%胎牛血清和1%抗生素-抗真菌溶液）的75 cm² 培养瓶中，以单层形式培养人结肠癌细胞HCT-116。
2. 将细胞置于37 °C、含5% CO₂ 的湿润环境中培养，每2至3天更换一次培养基，直至细胞融合度达到70%。
3. 为获得BNCT束流（例如中子束联合 BPA）及其通过重粒子杀伤癌细胞的效果，并使能量主要沉积于含硼癌细胞内，照射前一日向细胞培养基中加入硼递送剂——例如 ¹⁰BPA（4-硼-L-苯丙氨酸），终浓度为10 μg ¹⁰B/mL（0.925 mM），在照射前12–16小时加入（以达到最大硼摄取量）。
   注意：若使用其他尚未在BNCT研究中获得相关数据的细胞系，需测试各细胞系的硼摄取情况以确定最佳硼浓度。可参照Dagrosa研究组的方法，采用电感耦合等离子体原子发射光谱法（ICP-OES）测定 BPA的细胞摄取量。
4. 硼递送12–16小时后，吸除培养基，并用10 mL 1× PBS洗涤细胞。随后加入2 mL胰蛋白酶-EDTA溶液进行消化，在37 °C孵育5分钟以促进细胞脱落。当细胞开始脱落时，加入10 mL完全培养基以终止胰蛋白酶作用。
5. 将细胞悬液转移至15 mL离心管中，取10 µL细胞悬液与10 µL 0.4%台盼蓝混合后，取10 µL混合液加入细胞计数板，使用自动细胞计数仪进行计数。将细胞悬液调整至浓度为1 × 10⁶ 个细胞/mL，并按每支冻存管1 mL分装细胞悬液。
6. 准备热释光剂量计（TLDs）用于测量γ射线剂量，以及金箔用于测量中子通量，并在照射前将TLDs固定于冻存管或细胞培养瓶上。
7. 根据实验设施条件，将浓度为1 × 10⁶ 个细胞/mL的细胞置于培养瓶或冻存管中，使用混合中子束进行照射，推荐的最低热中子通量为5.9 × 10¹¹ (n/cm⁻² min⁻¹)⁴ 。
   注意：照射前应预先设定照射时间，以达到推荐的中子通量。
8. 照射后，取1 mL照射后的细胞悬液（含1 × 10⁶ 个细胞/mL）接种于35 mm培养皿或6孔板中的22 × 22 mm盖玻片上，加入2 mL相应培养基。将细胞置于37 °C、含5% CO₂ 的湿润环境中孵育最多3小时，使细胞贴附于盖玻片。期间定期使用倒置显微镜配合20倍物镜观察细胞贴壁情况。
   注意：对于HCT-116细胞，最低接种密度为600,000个细胞。若需快速进行后续染色操作，可使用腔室载玻片，并相应降低细胞接种密度。

2. 细胞固定

1. 照射并培养细胞后，移除贴壁细胞的培养基，并用 2.5 mL PBS 洗涤细胞一次。
2. 用 1 mL 70% 乙醇在室温下固定细胞 10 分钟。
   注意：也可根据先前建议使用 1%–3.7% 多聚甲醛（PFA）进行固定。此步骤可暂停。将固定后的细胞置于乙醇中，于 -20°C 冰箱内保存，时间不超过数周，以用于后续分析和免疫荧光染色。

3. 细胞透化

1. 固定后，从培养皿中移除乙醇，并用 2.5 mL 的 1x PBS 洗涤。
   注意：清洗步骤之间切勿让细胞干燥。
2. 轻柔加入 1 mL 的 0.2% Triton X-100/PBS，覆盖培养皿中的盖玻片及细胞。
3. 在室温下孵育 5 分钟。
4. 用 2.5 mL 的 1x PBS 洗涤细胞 3 次。
   注意：如有需要，可将 PBS 中 Triton X-100 的浓度提高至 0.5%（可检测到更多焦点，取决于所用细胞系）。可额外使用 PBST（含 0.5% Tween 的 PBS）进行洗涤，以避免非特异性结合。
5. 用 1 mL 含 2% BSA（牛血清白蛋白 V 组分）的 PBS 溶液进行封闭，孵育至少 30 分钟；或使用 1% BSA 孵育 1 小时。
   注意：此步骤可根据所用抗体类型省略。也可按推荐使用 5% FBS 进行封闭。

4. 免疫荧光染色

1. 按照推荐的稀释比例（参见推荐稀释比例的表1），将适量的一抗（Anti-ɣ-H2AX、Anti-DNA-PKcs 和 Anti-Rad52）用含BSA（2% 牛血清白蛋白V型）的PBS稀释（每份样品需要100 µL）。

一抗	功能	推荐稀释比例	保存温度 [°C]
Anti-ɣ-H2AX	检测DNA双链断裂（DNA-DSBs）	1:1000 (PBS-BSA)	4
Anti-DNA-PKcs	检测属于NHEJ通路的DNA-PKcs蛋白的辐射诱导焦点（RIFs）	1:200 (PBS-BSA)	-20
Anti-Rad52	检测属于同源重组修复（HRR）通路的Rad52蛋白的辐射诱导焦点（RIFs）	1:200 (PBS-BSA)	-20
二抗		避光
anti-mouse IgG FITC	ɣ-H2AX焦点检测	1:400 (PBS-BSA)	4
Goat Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488)	用于NHEJ和HRR修复蛋白焦点的检测	1:500 (PBS-BSA)	-20

表1：本节所用抗体的推荐稀释比例及使用说明

2. 将培养皿盖好，置于含有经蒸馏水湿润的木质素的塑料盒中以保持湿度，并在37 °C培养箱中孵育30分钟。
   注意： 此处可暂停实验流程。也可在4 °C过夜孵育。
3. 孵育结束后，用2.5 mL PBS洗涤3次。
   注意： 冲洗过程中切勿让玻片干燥。
4. 加入适量的二抗（抗小鼠IgG-FITC、抗兔IgG-山羊来源（Alexa Fluor 488）），用含BSA的PBS稀释（参见表1），每样本需100 µL。从本步骤开始及后续所有步骤均需避光操作。
5. 再次盖好培养皿，置于含有湿润木质素的塑料盒中以维持湿度，并在37 °C培养箱中孵育至少30分钟。
6. 孵育结束后，用2.5 mL PBS洗涤3次。
7. 加入100 µL DAPI，用PBS稀释至终浓度为1 µg/mL，用于细胞核复染。
8. 室温下避光短时间孵育，时间不超过2分钟。
9. 孵育结束后，用2.5 mL PBS洗涤3次。
10. 吸除PBS，小心地在封片剂上加盖盖玻片，避免产生气泡，并用指甲油密封盖玻片边缘。待指甲油完全干燥后，再在周围补涂一圈。
11. 在进行荧光显微镜成像分析前，需等待封片剂完全固化（最长可达3小时）。
    注意： 此处可暂停实验流程。将载玻片置于塑料盒中，于4 °C避光保存。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
12 mm 盖玻片	VWR	89015-725
35 mm 培养皿	Sarstedt	7.183.390.000
4-硼-L-苯丙氨酸	SIGMA-ALDRICH	17755
抗生素-抗真菌剂（100X）	Gibco	15240062
抗 DNA-PKcs（磷酸化 S2056）抗体 - 染色质免疫沉淀级	Abcam	AB18192
抗小鼠 IgG（全分子）– FITC 抗体，山羊来源	SIGMA-ALDRICH	F0257
抗磷酸化组蛋白 H2A.X（Ser139）抗体，克隆 JBW301	MerckMillipore	05-636
抗 RAD52 抗体	Abcam	AB117097
牛血清白蛋白 V 型（BSA）	Roche	BSAV-RO
DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚，二盐酸盐）	ThermoFisher SCIENTIFIC	D1306
胎牛血清（热灭活）	SIGMA-ALDRICH	F9665
山羊抗兔 IgG H&L（Alexa Fluor 488）	Abcam	AB150077
HCT-116 细胞系	ATCC	CCL-247™
ImageJ	美国国立卫生研究院（NIH）	https://imagej.nih.gov/ij/
Image Pro	Media Cybernetics	https://www.mediacy.com/imagepro
显微镜载玻片	ThermoFisher SCIENTIFIC	B-1198
磷酸盐缓冲液（PBS）	波兰科学院Hirszfeld免疫学与实验治疗研究所	20.59.52.0
吐温 X-100	SIGMA-ALDRICH	X100
台盼蓝染液，0.4%	Logos Biosystems	T13001
胰蛋白酶-EDTA 溶液 0.25%	SIGMA-ALDRICH	T4049