评估DNA损伤灶：利用免疫荧光染色法鉴定癌细胞系中辐射诱导的DNA损伤灶

摘要

来源：Maliszewska-Olejniczak 等。人结肠癌细胞中DNA损伤与修复焦点的免疫荧光成像。J. Vis. Exp. (2020)。

本视频介绍了一种利用免疫荧光染色法在结肠癌细胞系中检测辐射诱导的DNA修复灶的实验方案。DNA修复蛋白会在DNA损伤位点被激活；因此，我们可以使用特异性抗体对其进行检测，并在荧光显微镜下观察其定位。

方案

1. 细胞培养的准备与实验设置

1. 按照供应商建议，在含有10 mL配制的McCoy's 5a改良培养基（补充10%胎牛血清和1%抗生素-抗真菌溶液）的75 cm² 培养瓶中，以单层形式培养人结肠癌细胞HCT-116。
2. 将细胞置于37 °C、含5% CO₂ 的湿润环境中培养，每2至3天更换一次培养基，直至细胞融合度达到70%。
3. 为获得BNCT束流（例如中子束联合 BPA）及其通过重粒子杀伤癌细胞的效果，并使能量主要沉积于含硼癌细胞内，照射前一日向细胞培养基中加入硼递送剂——例如 ¹⁰BPA（4-硼-L-苯丙氨酸），终浓度为10 μg ¹⁰B/mL（0.925 mM），在照射前12–16小时加入（以达到最大硼摄取量）。
   注意：若使用其他尚未在BNCT研究中获得相关数据的细胞系，需测试各细胞系的硼摄取情况以确定最佳硼浓度。可参照Dagrosa研究组的方法，采用电感耦合等离子体原子发射光谱法（ICP-OES）测定 BPA的细胞摄取量。
4. 硼递送12–16小时后，吸除培养基，并用10 mL 1× PBS洗涤细胞。随后加入2 mL胰蛋白酶-EDTA溶液进行消化，在37 °C孵育5分钟以....

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
12 mm 盖玻片	VWR	89015-725
35 mm 培养皿	Sarstedt	7.183.390.000
4-硼-L-苯丙氨酸	SIGMA-ALDRICH	17755
抗生素-抗真菌剂（100X）	Gibco	15240062
抗 DNA-PKcs（磷酸化 S2056）抗体 - 染色质免疫沉淀级	Abcam	AB18192
抗小鼠 IgG（全分子）– FITC 抗体，山羊来源	SIGMA-ALDRICH	F0257
抗磷酸化组蛋白 H2A.X（Ser139）抗体，克隆 JBW301	MerckMillipore	05-636
抗 RAD52 抗体	Abcam	AB117097
牛血清白蛋白 V 型（BSA）	Roche	BSAV-RO
DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚，二盐酸盐）	ThermoFisher SCIENTIFIC	D1306
胎牛血清（热灭活）	SIGMA-ALDRICH	F9665
山羊抗兔 IgG H&L（Alexa Fluor 488）	Abcam	AB150077
HCT-116 细胞系	ATCC	CCL-247™
ImageJ	美国国立卫生研究院（NIH）	https://imagej.nih.gov/ij/
Image Pro	Media Cybernetics	https://www.mediacy.com/imagepro
显微镜载玻片	ThermoFisher SCIENTIFIC	B-1198
磷酸盐缓冲液（PBS）	波兰科学院Hirszfeld免疫学与实验治疗研究所	20.59.52.0
吐温 X-100	SIGMA-ALDRICH	X100
台盼蓝染液，0.4%	Logos Biosystems	T13001
胰蛋白酶-EDTA 溶液 0.25%	SIGMA-ALDRICH	T4049