1. 细胞接种
<ol>
	<li>在24孔板中每孔接种2 × 105&#160;个HCT116结直肠癌细胞，并在37 °C条件下用杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）培养过夜。</li>
	<li>更换培养基，加入含或不含100 µM硫酸亚铁（FS）或10 µM阿霉素（DOX）的培养基，继续孵育24小时。</li>
</ol>
2. DCFH-DA 溶液的制备
<ol>
	<li>将 4.85 mg DCFH-DA 溶解于 1 mL 二甲基亚砜（DMSO）中，配制成 10 mM 的储备液。</li>
	<li>在加入孔板前，用预热的 DMEM 将储备液稀释成 10 µM 的工作液。</li>
	<li>将工作液涡旋振荡 10 秒。</li>
</ol>

3. DCFH-DA 染色
<ol>
	<li>移除含药物的培养基，并用 DMEM 洗涤一次。</li>
	<li>向每孔加入 500 µL DCFH-DA 工作液，在 37 °C 孵育 30 分钟。</li>
	<li>移除 DCFH-DA 工作液，用 DMEM 洗涤一次，再用 1× 磷酸盐缓冲液 (PBS) 洗涤两次。</li>
	<li>向每孔加入 500 µL 1× PBS。</li>
</ol>
4. 成像采集与强度测量
<ol>
	<li>使用荧光显微镜的绿色荧光蛋白（GFP）通道，为每个孔拍摄具有代表性的荧光图像。</li>
	<li>拍摄图像后，移除 PBS，并向每个孔中加入 200 µL 放射免疫沉淀分析（RIPA）裂解液。</li>
	<li>冰上孵育 5 分钟，然后将细胞裂解液收集至 1.5 mL 离心管中。</li>
	<li>在 4 °C 下以 21,130 x&#160;g&#160;离心 10 分钟。</li>
	<li>将 100 µL 上清液转移至黑色 96 孔板中，使用荧光酶标仪在激发波长 485 nm 和发射波长 530 nm 下测定荧光强度。</li>
	<li>将 1 µL 上清液转移至含有 100 µL 1× 蛋白检测试剂的透明 96 孔板中，采用 Bradford 法测定蛋白浓度。</li>
	<li>以蛋白浓度对荧光强度进行归一化处理。</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>2',7'-二氯荧光素二乙酸酯</td><td>Cayman Chemical, Ann Arbor, MI</td><td>20656</td><td></td></tr><tr><td>盐酸多柔比星</td><td>TCI America, Portland, OR</td><td>D4193-25MG</td><td></td></tr><tr><td>杜尔贝科改良伊格尔培养基</td><td>Corning, Corning, NY</td><td>45000-304</td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen EVOS FL Auto 成像系统</td><td>Thermo Fisher Scientific Waltham, MA</td><td>AMAFD1000</td><td>或任何其他荧光显微镜</td></tr><tr><td>Bradford 蛋白检测试剂</td><td>Bio-Rad, Hercules, CA</td><td>5000001</td><td></td></tr><tr><td>SpectraMax M2 微孔板读板仪</td><td>Molecular Devices, Radnor, PA</td><td>89429-532</td><td>或任何其他荧光微孔板读板仪</td></tr><tr><td>七水合硫酸亚铁</td><td>VWR, Radnor, PA</td><td>97061-542</td><td></td></tr></tbody></table>

使用dcfh-da染色法检测活性氧：测定结直肠癌细胞系中的总活性氧水平

ROS Detection with DCFH-DA Staining: Measuring Total ROS in Colorectal Cancer Cell Lines

来源：Kim, H., 等. <a href="https://www.jove.com/v/60682">利用2',7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯染色法检测贴壁细胞中的总活性氧种类</a>。J. Vis. Exp. (2020)。
本视频介绍了使用2',7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）检测细胞内总活性氧（ROS）的实验方案。该方法可通过荧光显微镜观察贴壁细胞中活性氧的定位，并利用荧光酶标仪进一步定量活性氧的荧光强度。

使用DCFH-DA染色法检测活性氧：测定结直肠癌细胞系中的总活性氧水平

来源：Kim, H. 等。利用2',7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯染色法检测贴壁细胞中的总活性氧。J. ...

— 活性氧主要在线粒体中产生，当电子从电子传递链泄漏时，会与分子氧结合，生成多种活性氧（ROS）。在癌细胞中，活性氧的生成量显著增加。这些高反应性的ROS分子可对细胞内的膜结构、蛋白质和DNA造成氧化损伤。
活性氧（ROS）水平升高可损伤DNA，导致致癌信号通路的激活，从而促进癌症进展。因此，检测癌细胞产生的活性氧水平至关重要。
首先，从人结直肠癌组织中获取癌细胞，并将其置于适当的培养基中培养。接着，将这些细胞接种至多孔板中，并加入DCFH-DA溶液。将多孔板孵育所需的时间。DCFH-DA可穿过细胞膜。进入细胞后，在细胞内酯酶的作用下，DCFH-DA转化为DCFH。随后，DCFH被活性氧物种氧化，生成绿色荧光分子。
在荧光显微镜下观察细胞。绿色荧光的强度表示细胞内活性氧的水平。在以下实验方案中，我们使用 DCFH-DA 染料对结直肠癌细胞中的活性氧进行染色。
— 为了染色细胞，移除含有药物的培养基，并用 DMEM 洗涤一次。每孔加入 500 微升 DCFH-DA 工作液，在 37 摄氏度下孵育 30 分钟。孵育结束后，从孔中移除 DCFH-DA 溶液，用 DMEM 洗涤两次，再用 PBS 洗涤一次。
然后，向每个孔中加入 500 微升 PBS。使用荧光显微镜的绿色荧光蛋白通道拍摄细胞的代表性图像。随后，移除 PBS，并向每个孔中加入 200 微升放射免疫沉淀分析缓冲液。
将培养板置于冰上孵育五分钟，然后将细胞裂解物收集到1.5毫升离心管中。在4摄氏度下，以21,130 × g离心10分钟。随后，将100微升上清液转移至黑色96孔板中。使用酶标仪在激发波长485纳米、发射波长530纳米的条件下测定各孔的荧光强度。
接着，通过将1 µL上清液转移至含100 µL蛋白检测试剂的透明96孔板中，使用Bradford法测定蛋白浓度。利用蛋白浓度对荧光强度进行归一化处理。

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使用 DCFH-DA 染色进行 ROS 检测:测量结直肠癌细胞系中的总 ROS

5.7K 次观看. - 当电子从电子传递链中泄漏出来时，活性氧主要由线粒体产生。这些电子与分子氧结合，产生各种活性氧 （ROS）。在癌细胞中，活性氧产生过量。这些高反应性 ROS 分子可以氧化损伤细胞内的膜、蛋白质和 DNA。 ROS 水平升高会损害 DNA，导致致癌信号通路激活，从而导致癌症进展。因此，检测癌细胞产生的活性氧水平至关重要。 首先在适当的培养基中取人结直肠?...

使用DCFH-DA染色法检测活性氧：测定结直肠癌细胞系中的总活性氧水平

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材料

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姓名	公司	目录编号	评论
2',7'-二氯荧光素二乙酸酯	Cayman Chemical, Ann Arbor, MI	20656
盐酸多柔比星	TCI America, Portland, OR	D4193-25MG
杜尔贝科改良伊格尔培养基	Corning, Corning, NY	45000-304
Invitrogen EVOS FL Auto 成像系统	Thermo Fisher Scientific Waltham, MA	AMAFD1000	或任何其他荧光显微镜
Bradford 蛋白检测试剂	Bio-Rad, Hercules, CA	5000001
SpectraMax M2 微孔板读板仪	Molecular Devices, Radnor, PA	89429-532	或任何其他荧光微孔板读板仪
七水合硫酸亚铁	VWR, Radnor, PA	97061-542