建立结直肠癌PDOX小鼠模型：在小鼠模型中研究结直肠癌的进展 结直肠癌, PDOX模型, 小鼠模型, 肿瘤异种移植, 癌症进展, 原位移植, 患者来源的异种移植, 肿瘤微环境, 转移, 预临床模型

摘要

来源： Moret, R. 等. 人尿路上皮细胞癌和结直肠癌肿瘤生长及自发转移的患者来源异位移植模型。 J. Vis. Exp. (2019)。

本视频介绍了建立患者来源的异位移植结直肠癌小鼠模型的实验方案，用于研究结直肠癌细胞在非肥胖型糖尿病/重度联合免疫缺陷（NOD/SCID）小鼠体内的进展过程。该小鼠模型有助于理解原发肿瘤的生长特性及转移模式。

方案

所有涉及动物的实验程序均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 细胞系培养

1. 在37 °C、5% CO₂ 的湿润培养箱中，使用添加了10%胎牛血清、2 nM谷氨酰胺、100 U/mL青霉素G和100 mg/mL链霉素的完全RPMI-1640培养基培养HK细胞。
   注意：HK细胞为正常人滤泡树突状细胞，可在体外培养并传代扩增，传代次数不超过15代。

2.  荧光素酶标记肿瘤的标记与富集

1. 将肿瘤直接植入6-8周龄雌性NOD/SCID小鼠的左右侧 flank 部位。
2. 使用数字卡尺每两周测量一次肿瘤生长情况。
3. 当肿瘤直径达到1 cm时，进行肿瘤转导。使用1 cc注射器配合27 G针头，将单剂量的Luc/红色荧光蛋白（RFP）-慢病毒（每瘤50 µL，用高滴度浓缩慢病毒原液按1:30稀释）直接注射入肿瘤内。
   注意： 患者来源的肿瘤通常在1-2个月内达到1 cm直径。然而，其生长速率差异极大，取决于多种因素，包括肿瘤分级和类型。

3. 结直肠癌小鼠模型

1. 将一只六至八周龄的雄性NOD/SCID小鼠置于诱导室中，使用异氟烷（2.5%溶于100%氧气，流速1 L/min）进行麻醉。通过脚趾夹捏确认麻醉效果。
2. 将麻醉后的小鼠仰卧置于解剖显微镜下，确保其鼻部固定于异氟烷鼻罩，并用胶带固定前肢以保持稳定。
   注意：可使用放大镜代替解剖显微镜。可在尾部基底下方放置一个小物体以改善视野和操作角度，从而抬高肛门。通常将纱布小片卷成直径约1英寸的圆柱形使用。
3. 使用弯曲、润滑且钝头的镊子扩张肛管，以暴露远端肛门及直肠黏膜。清除粪便。
4. 使用连接50 μL玻璃注射器的无菌30 G可拆卸针头，将10 μL含荧光素酶标记的肿瘤细胞与HK细胞（为构建结直肠癌模型，每只小鼠使用完全RPMI培养基重悬10 µL肿瘤细胞）注射至肛管上方1至2 mm处的远端后侧直肠黏膜下层。针头斜面应被黏膜覆盖。注意避免穿入盆腔。
5. 将小鼠从异氟烷鼻罩移开。术后观察1小时，注意是否有痛苦迹象，例如弓背、呼吸困难等。

4. 生物发光成像

1. 使用生物发光成像系统每周监测原发肿瘤、肝脏和肺部转移负荷，检测荧光素酶活性。
   1. 取小鼠结直肠癌实验模型并称重。按150 mg/kg剂量腹腔注射荧光素，注射后等待5分钟，使底物在小鼠体内循环。
   2. 在诱导室中使用2.5%异氟烷（溶于100%氧气，流速1 L/min）对小鼠进行麻醉。
   3. 将小鼠放入生物发光成像仪中，鼻部固定于鼻罩内。拍摄图像时，确保感兴趣区域正对相机。对于结直肠癌注射模型，每次成像时应使小鼠腹侧朝向相机，以仰卧位进行成像。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
RPMI-1640 培养基	American Type Culture Collection	110636
异氟烷	Henry Schein Animal Health	108333
D-荧光素（150 mg/kg）	Perkin Elmer	122796
谷氨酰胺（2 nM）	Fisher Scientific	35050061
Luc/RFP-慢病毒	来自我们的合作者。参见参考文献13：Gills, J. 等。一种源自患者的正位异种移植模型，用于实现人膀胱高级别尿路上皮细胞癌的肿瘤植入、生长、血管生成及转移。Oncotarget. 9, 32718-32729, doi:10.18632/ oncotarget.26024 (2018)。
青霉素/链霉素 100 mL（100 U/mL）	Fisher Scientific	15140-122
气体
100% 氧气	Airgas Inc	OX USP200
100% CO2	Airgas Inc	CD USPE
小鼠
6-8 周龄 NOD/SCID 小鼠（雌性）	Jackson Lab	1303
工具
15 mL 锥形离心管	Sarstedt	11799
150 mm 组织培养皿	USA Scientific Inc	CC7682-3614
镊子	Symmetry Surgical Inc	06-0011
手术剪刀	Symmetry Surgical Inc	02--2011
设备
5% CO2 恒温湿化培养箱	Thermo Scientific	3110
生物发光成像仪（BLI）	Perkin Elmer	CLS136334
生物发光成像仪软件（BLI）	Perkin Elmer	CLS136335
数字卡尺	Fowler Tools and Instruments	54-115-330
解剖显微镜	Precision Instruments LLC	(504) 228-0076
异氟烷诱导室	Perkin Elmer	119038