预靶向放射免疫疗法：一种将治疗性放射性核素靶向递送至肿瘤的方法

摘要

来源：Membreno, R.，等。基于逆电子需求Diels-Alder反应的预靶向放射免疫治疗。J. Vis. Exp. (2019)。

本视频介绍了预靶向放射免疫治疗（PRIT）技术，该技术通过先给予免疫偶联物，再给予放射性配体，以治疗肿瘤。这种放射免疫治疗可降低对健康组织的辐射剂量，并可使用半衰期极短、无法与基于抗体的载体兼容的放射性核素。

方案

涉及动物模型的所有操作均已被当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会审核。

1. huA33-TCO 的制备

注意： 人源化A33-TCO的合成此前已有报道。然而，为方便读者理解，本文在此重新描述该过程，并对条件进行了优化调整。

1. 在1.7 mL微量离心管中，用无水二甲基甲酰胺（DMF）配制125 μL浓度为40 mg/mL（0.15 M）的(E)-环辛-4-烯基 2,5-二氧代-1-吡咯烷基碳酸酯（TCO-NHS）溶液。该溶液可分装后于-80 °C冷冻保存，供后续实验使用。
2. 在另一个1.7 mL微量离心管中，用1 mL磷酸盐缓冲液（PBS；含2.7 mM氯化钾、137 mM氯化钠和11.9 mM磷酸钾，pH 7.4）配制5 mg/mL的人源化A33抗体（huA33）溶液。
3. 使用少量（<5 μL）0.1 M Na₂CO₃溶液，将步骤1.2中抗体溶液的pH调节至8.8–9.0。使用pH试纸或配备微电极的pH计监测pH值，并注意避免pH超过9.0。
4. 向步骤1.3所述的抗体溶液中，缓慢加入相当于抗体摩尔量40倍的TCO-NHS体积。例如，若溶液中含有5 mg（30 nmol）huA33，则加入9.0 μL（1.20 μmol）浓度为40 mg/mL（0.15 M）的TCO-NHS溶液。
   注意：TCO-NHS具有疏水性。加入抗体溶液时应缓慢并伴随搅拌，以防止沉淀。最终反应体系中DMF的体积不得超过10%。
5. 将反应体系置于25 °C恒温混匀仪中，在温和振荡（500 rpm）条件下孵育1小时。
6. 孵育1小时后，使用预装的一次性尺寸排阻脱盐柱纯化huA33-TCO免疫偶联物。
   1. 按照供应商说明对尺寸排阻柱进行平衡，以去除储存过程中可能存在的防腐剂。典型操作为用相当于柱体积的PBS洗涤5次：即5 × 2.5 mL PBS。
   2. 将反应混合物加至尺寸排阻柱中，并记录反应混合物体积。
   3. 待反应混合物完全进入柱体后，加入适量PBS，使上样总体积达到2.5 mL。例如，若偶联反应后总体积为1.3 mL，则需额外加入1.2 mL PBS。
   4. 用2 mL PBS作为洗脱液收集产物。
      注意：此步骤将获得最终产物huA33-TCO，溶于2 mL PBS（pH 7.4）中。
7. 使用紫外-可见分光光度计在280 nm波长处测定huA33-TCO的浓度。大多数IgG的摩尔消光系数（ε₂₈₀）为210,000 M^-1cm^-1。
8. 若需要更高浓度的免疫偶联物溶液，可使用截留分子量为50,000的离心过滤装置，按照制造商说明对huA33-TCO溶液进行浓缩。
   注意：许多抗体在浓缩过程中可能发生聚集或沉淀。当使用新型抗体进行该操作时，研究人员应参考相关文献或依据自身对该抗体的操作经验谨慎处理。
9. 若需立即使用，将制备完成的huA33-TCO免疫偶联物避光保存于4 °C；若计划在4天以后使用，则应避光保存于-80 °C。
   注意：本步骤可作为实验的合理暂停点。制备完成的huA33-TCO免疫偶联物在-80 °C避光保存条件下至少可稳定6个月。

2. Tz-PEG₇-NHBoc 的合成

1. 在1.7 mL 微量离心管中，溶解5 mg 四嗪 N-hydroxysuccinimidyl ester（Tz-NHS；12.6 μmol）溶于0.15 mL无水二甲基亚砜（DMSO）中。
2. 在另一个1.7 mL微量离心管中，溶解8 mg的Boc保护氨基PEG聚合物O-(2-氨基乙基)-O'-[2-(Boc-氨基)乙基]六乙二醇（NHBoc-PEG7-NH）₂；17.1 μmol）溶于0.15 mL无水DMSO中。
3. 向 Tz-NHS 溶液中加入 3 μL（21.3 μmol，1.7 当量）三乙胺（TEA），充分混匀。
4. 将粉红色的四嗪溶液加入 NHBoc-PEG₇-NH₂ 将步骤2.2中的溶液加入并混匀，室温（RT）轻度振荡孵育30分钟。
5. 30分钟后，用H将反应混合物按1:1稀释₂O 并使用反相 C₁₈ 高效液相色谱法（HPLC）分离未反应的四嗪-NHS与四嗪-聚乙二醇₇-NHBoc。使用无酸溶剂以防止Boc保护基过早脱除。同时监测Tz-PEG₇-NHBoc 和 Tz-NHS 在 525 nm 波长下的情况。
   注意： 保留时间高度依赖于各实验室的高效液相色谱（HPLC）设备（泵、色谱柱、管路等），在纯化前应运行适当的对照。然而，作为示例，若采用5:95乙腈/水梯度洗脱₂O（两者 无 任何添加剂）至95:5乙腈/水₂在30分钟内，流速为1 mL/min，采用分析型4.6 mm × 250 mm C₁₈ 色谱柱被使用时，Tz-NHS 和 Tz-PEG 的保留时间₇-NHBoc 的保留时间分别为约 16 分钟和 18 分钟。
6. 使用液氮冷冻收集的HPLC洗脱液，并用铝箔包裹已冻结的收集管。将冻结的收集管置于冷冻干燥机中过夜，以去除HPLC流动相。所得产物为特征性的亮粉色固体。
   注意： 若无液氮，可将收集的HPLC洗脱液置于干冰中或-80 °C超低温冰箱中过夜冷冻。

3. Tz-PEG₇-NH₂ 的合成

1. 将步骤 2.6 的产物 Tz-PEG₇-NHBoc，加入1.5 mL二氯甲烷（DCM），并将该溶液转移至一个小的圆底烧瓶中。
2. 向第3.1步的粉红色溶液中逐滴加入0.25 mL三氟乙酸（TFA）。
3. 在室温下轻轻振荡孵育反应体系30分钟。
4. 30 分钟后，蒸发溶剂 通过 旋转蒸发。水浴温度不得超过37 °C。
5. 将粉红色粘稠物用0.5 mL水溶解。
6. 使用反相C纯化产物₁₈ 高效液相色谱法分离Tz-PEG₇-NH₂ 从Boc保护的前体中。同时监测Tz-PEG₇-NHBoc 和 Tz-PEG₇-NH₂ 在525 nm波长下。
   注意： 保留时间高度依赖于各实验室的高效液相色谱（HPLC）设备（泵、色谱柱、管路等），在纯化前应运行适当的对照。然而，作为示例，若采用5:95乙腈/水梯度洗脱₂O（均含0.1% TFA）至95:5 MeCN/H₂在30分钟内，流速为1 mL/min，采用分析型4.6 mm × 250 mm C₁₈ 色谱柱被使用时，Tz-PEG 的保留时间₇-NHBoc 和 Tz-PEG₇-NH₂ 分别为 18 分钟和 13 分钟。
7. 使用液氮冷冻收集的HPLC洗脱液，并用铝箔包裹已冻结的收集管。将冻结的收集管置于冻干机中过夜，以去除HPLC流动相。产物为亮粉色固体。
8. 将第3.7步得到的产品Tz-PEG重新溶解₇-NH₂，加入150 μL DMSO，转移至1.7 mL微量离心管中。
9. 测定 Tz-PEG 的浓度₇-NH₂ 使用紫外-可见分光光度计在525 nm波长下监测。Tz-PEG的摩尔消光系数₇-NH₂ (ε₅₂₅) 为 535 M^-1cm^-1.

4. Tz-PEG₇-DOTA 的合成

1. 溶解 Tz-PEG₇-NH₂ （4.5 mg，6.9 μmol）溶于0.15 mL DMSO中（或直接使用3.8步制备的溶液）。
2. 向第4.1步含四嗪的溶液中加入22当量的TEA（21 μL，0.15 mmol）。
3. 加入10 mg（14.2 μmol）的 p-SCN-Bn-DOTA 为固体，涡旋溶液约 2 分钟，直至物质完全溶解。
4. 在室温下轻轻振荡孵育反应体系30分钟。
5. 30 分钟后，用 H 按 1:1 比例稀释反应液₂O，并使用反相C₁₈ 高效液相色谱法去除未反应物 p-SCN-Bn-DOTA。该 p-SCN-Bn-DOTA 可在 254 nm 波长下进行监测，而 Tz-PEG₇-DOTA 在 525 nm 波长下监测效果最佳。
   注意： 保留时间明显高度依赖于各实验室的高效液相色谱设备（泵、色谱柱、管路等），因此在纯化前应运行适当的对照。然而，作为示例，若采用5:95乙腈/水的梯度洗脱₂O（均含0.1% TFA）至95:5乙腈/水₂O 在30分钟内，采用分析型4.6 x 250 mm C₁₈ 使用色谱柱时，采用 Tz-PEG₇-DOTA 和 p-SCN-Bn-DOTA 的保留时间分别约为 15.6 min 和 16.1 min。
6. 使用液氮冷冻收集的HPLC洗脱液，将已冻结的收集管用铝箔包裹。将冷冻后的收集管置于冻干机中过夜，以去除HPLC流动相。产物为亮粉色粉末。
7. 用 0.15 mL DMSO 重悬产品，并使用紫外-可见分光光度计在 525 nm 波长处测定其浓度。Tz-PEG 的摩尔消光系数₇-DOTA（ε）₅₂₅为535 M^-1厘米^-1.
8. 通过核磁共振（NMR）和高分辨质谱（HRMS）对最终化合物进行分析，以确认合成成功。参见 表1 针对本研究中讨论的所有化合物的实验测定化学位移和分子量。
9. 储存纯化的 Tz-PEG₇-DOTA 溶液避光保存于 -80 °C。
   注意： 这是该实验流程中一个可接受的暂停点。已完成的Tz-PEG₇-DOTA前体在这些条件下至少可稳定保存1年。

5. ¹⁷⁷Lu 对 Tz-PEG₇-DOTA 的放射性标记

注意：本实验步骤涉及放射性物质的操作与处理。在进行这些步骤之前——或进行任何其他涉及放射性的工作之前——研究人员应咨询所在机构的辐射安全部门。应采取一切可能措施，以尽量减少电离辐射的暴露。

注意：处理少量放射性金属时，建议所有缓冲液均不含痕量金属，以防止干扰配位位点的结合。

1. 在1.7 mL离心管中，加入200 μL用1 M HCl逐份调节至pH 5.5的0.25 M乙酸铵缓冲液。
   注意：若用于标记的放射性活度低于370 MBq，则缓冲液体积应减少至100 µL。
2. 将所需量的[¹⁷⁷Lu]LuCl₃加入缓冲溶液中。加入量取决于实验中的受试对象数量及给予的放射性剂量。建议额外增加1-2份剂量的放射性活度，以预防纯化步骤中可能发生的放射性损失。
3. 将DMSO中的Tz-PEG₇-DOTA加入第5.2步的放射性混合物中。Tz-PEG₇-DOTA的用量取决于待测受试对象的数量。有关此问题的更多细节，请参见第6.2.2.2步。
4. 将溶液在37 °C孵育20分钟。
5. 使用以50 mM EDTA（pH 5.5）为流动相的放射性即时薄层色谱法（radio-iTLC）验证标记是否完全。标记产物[¹⁷⁷Lu]Lu-DOTA-PEG₇-Tz将停留在起始线处——R_f = 0，而游离的[¹⁷⁷Lu]Lu³⁺会被EDTA螯合并随溶剂前沿迁移，R_f = 1.0（图1B）。
6. 若未实现定量标记，可添加配体以螯合游离放射性金属。或者，使用C₁₈固相萃取柱纯化标记产物[¹⁷⁷Lu]Lu-DOTA-PEG₇-Tz。请遵循制造商的使用说明。以下提供一个示例操作流程：
   1. 用大规格注射器缓慢将5 mL乙醇通过C₁₈柱进行预处理。随后依次通过5 mL乙腈和5 mL去离子（DI）H₂O。
   2. 用较小的注射器吸取第5.3步的放射性配体溶液，并缓慢注入C₁₈柱上。然后用10 mL去离子水洗涤柱子，以去除未结合的[¹⁷⁷Lu]LuCl₃。
   3. 用500 µL乙醇洗脱。通过低流速干燥氮气或氩气吹扫10-15分钟，去除终产物中的乙醇。随后，将放射性配体重悬于生理盐水中，体积根据第6.2.2.2步确定。

6. 在体 研究

注意： 与第5节相同，本实验步骤涉及放射性物质的操作与处理。在执行这些步骤之前，研究人员应咨询所在机构的辐射安全部门。应采取一切可能的措施，以尽量减少电离辐射的暴露。

1. 动物的准备
   1. 在雌性裸鼠（无胸腺裸鼠）中，皮下植入 5 x 10⁶ SW1222 结直肠癌细胞悬浮于 150 μL 细胞培养基与基质按 1:1 比例混合的溶液中例如，Matrigel）并使其生长至100-150 mm³ 异种移植（接种后14-18天）
   2. 用于生物分布实验的动物分组
      1. 当通过游标卡尺测量确定肿瘤达到足够大小后，对动物进行分组，以确保每个队列的平均肿瘤体积大致相同。可在每个笼子中用永久性墨水在尾巴上做标记（一条带、两条带等）以区分不同动物。.).
   3. 纵向治疗研究中的动物分组
      1. 当肿瘤生长至通过游标卡尺测量确定的足够大小后，为每只动物佩戴耳标，以确保在整个实验过程中能够准确追踪。
         注意： 数字耳标在实验过程中可能会脱落。因此，建议以系统化的方式将这些物理耳标与耳缘剪口标记配合使用即.，右侧，左侧，双侧，右侧 × 2，左侧 × 2
   4. 将动物分组，使各组的平均肿瘤体积大致相等。以下动物分组方法可使用电子表格程序完成。
      1. 将动物编号、耳缘缺口模式和肿瘤体积分别列在三列中。
      2. 将数据按肿瘤体积从小到大排序。
      3. 在第四列中，为每只动物分配一个笼号，并以蛇形模式循环排列笼子。例如，如果有 5 个笼子，该列将按此方式填充 "5, 4, 3, 2, 1, 1, 2, 3, 4, 5..." 直到所有动物都被分配到笼具中。
      4. 分配笼位后，按笼号对数据进行排序。若使用耳缘缺口标记，需确保同一笼内每只动物具有独特的耳缘缺口模式。若某笼内出现重复模式（两个或以上相同模式），则将其中一只小鼠与另一笼中缺少该模式的小鼠进行调换，直至每笼内所有小鼠的耳缘缺口模式均唯一。
2. 配方与注射
   注意： 生物分布和治疗研究的注射顺序如下：首先注射 huA33-TCO，随后注射 [¹⁷⁷Lu]Lu-DOTA-PEG₇预设时间间隔后的 Tz。
   1. 免疫偶联物
      1. 将步骤1.9中的huA33-TCO溶液等分试样用0.9%无菌生理盐水稀释至浓度为0.8 mg/mL。
      2. 用预先用含1%牛血清白蛋白（BSA）的PBS处理过的注射器吸取150 µL（100 µg）的huA33-TCO溶液，并将这些注射器置于冰上保存。
         注意： BSA 处理可减少抗体与注射器管壁的非特异性结合。
      3. 在加热灯下将动物加热3分钟，以扩张尾静脉。
      4. 将 huA33-TCO 溶液注入荷瘤小鼠的尾静脉。静置 24 小时（或其它预先设定的时间间隔），使 huA33-TCO 在小鼠肿瘤中充分富集。
   2. 放射性配体
      1. 放射性标记 Tz-PEG₇- 第5节中所述的DOTA
      2. 用含有1.1摩尔当量Tz-PEG的150 μL 0.9%无菌生理盐水配制剂量₇-DOTA 与给予的 huA33-TCO 量之间的相对关系。例如，若向动物注射了 100 μg（0.67 nmol）的 huA33-TCO，且 [¹⁷⁷Lu]Lu-DOTA-PEG₇-Tz 反应混合物的比活度为 12.4 GBq/μmol，随后分装的每份剂量含有 9.14 MBq 放射活性。这相当于 0.74 nmol 的 Tz（相对于 huA33-TCO 为 1.1 摩尔当量）。
      3. 在加热灯下将动物加热 3 分钟以扩张尾静脉。
      4. 将放射性配体剂量注入荷瘤小鼠的尾静脉。注射的放射性活度由研究人员确定。已有发表数据显示，在7.4 - 55.5 MBq范围内，肿瘤大小呈现剂量依赖性的治疗效果。

结果

图1：(A) [ ¹⁷⁷Lu]Lu-DOTA-PEG₇-Tz放射性标记的示意图；(B) 典型的放射性iTLC色谱图，显示[¹⁷⁷Lu]Lu-DOTA-PEG₇-Tz的放射化学纯度>98%。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
(E)-环辛-4-烯基 2,5-二氧代-1-吡咯烷基碳酸酯（TCO-NHS） 	Sigma-Aldrich	764523	于 -80 °C 保存
2,5-二氧代-1-吡咯烷基 5-[4-(1,2,4,5-四嗪-3-基)苄基氨基]-5-氧代戊酸酯（Tz-NHS）   	Sigma-Aldrich	764701	于 -80 °C 保存
乙腈（MeCN）  	Fisher Scientific	A998-4
乙酸铵（NH4OAc）  	Fisher Scientific	A639-500
Boc-PEG7-胺（O-(2-氨基乙基)-O′-[2-(Boc氨基)乙基]六乙二醇）  	Sigma-Aldrich	70023	于 -20 °C 保存
二氯甲烷（DCM） 	Fisher Scientific	D143-1
二甲基亚砜（DMSO），无水  	Fisher Scientific	D12345
EMD Millipore Amicon Ultra-2 离心过滤装置 	Fisher Scientific	UFC205024
GE Healthcare 一次性 PD-10 脱盐柱  	Fisher Scientific	45-000-148
N,N-二甲基甲酰胺（DMF），无水 	Fisher Scientific	AC610941000
磷酸盐缓冲液（PBS）  	Fisher Scientific	70-011-044 	10 倍浓缩液
p-SCN-Bn-DOTA 	Macrocyclics	B-205 	于 -20 °C 保存
三乙胺（TEA） 	Fisher Scientific	AC157911000
三氟乙酸（TFA） 	Fisher Scientific	A116-50
肿瘤测量仪  	Peira 	Peira TM900