循环 miRNA 提取:一种通过有机提取和小 RNA 富集从血浆样品中分离 miRNA 的方法

摘要

来源:Canale， M. 等人， 转移性结直肠癌患者中循环 MicroRNA 定制面板的检测。J. Vis. Exp. （2019 年）。

该视频介绍了使用有机提取后玻璃纤维柱富集从结直肠癌患者的血浆样本中提取循环 microRNA。miRNA 在血清和血浆等生物体液中稳定，这使它们成为癌症诊断、预后以及治疗决策和监测的理想循环生物标志物。这种方法将有助于识别能够预测患者临床结果的新循环生物标志物。

方案

注意:根据良好实验室规范 （GLP），在无菌通风橱下执行以下所有步骤。

1. 血浆采集和储存

1. 在 K3E EDTA 管中收集 3 mL 外周血样品。
在
2. 室温下以 1,880 x g 离心管 15 分钟。
3. 以 450 μL 的等分试样回收上清液血浆。
4. 将样品储存在 -80 °C 直至使用><。 注意:在收集后 2 小时内处理外周血管。从试管中回收血浆时，请勿干扰淋巴细胞层。

2. 从血浆样品中提取循环 miRNA

1. 准备所有必需的溶液并解冻用于提取步骤的样品。
   1. 将 375 μL 2-巯基乙醇添加到 2x 变性溶液中并充分混合。
   2. 向 miRNA 洗涤液 I 中加入 21 mL ACS 级 100% 乙醇并充分混合。
   3. 将 40 mL ACS 级 100% 乙醇加入洗涤液 2/3 中并充分混合。
   4. 让血浆等分试样在室温下解冻，然后开始提取步骤。

2. 有机萃取
   1. 将 400 μL 血浆样品转移到不含 RNase 的 2 mL 试管中。
   2. 加入 400 μL 2x 变性溶液，涡旋混合并短暂离心。
   3. 加入 4 μL 1 nM 加标，涡旋混合并短暂离心。
   4. 加入 800 μL 酸性苯酚-氯仿。
   5. 涡旋 60 秒，然后以最大速度 （≥10,000 x g） 离心 15 分钟。
   6. 将上层水相转移到新试管中。不要打扰间期。记下回收的体积并丢弃含有非水相的试管。
      注意: 2x 变性溶液储存在 4 °C 下，在此温度下可能会凝固。使用前，将溶液加热至 37 °C，偶尔搅拌 10-15 分钟。小心提取含有酸性苯酚-氯仿的底相，而不是位于混合物顶部的水性缓冲液。将洗脱液或无核酸酶的水预热至 95 °C。小心加热足量的溶液（每个样品 100 μL + 10% 过量）。

1. 小 RNA 富集
   1. 将 1/3 体积的乙醇 100% 添加到步骤 2.2.6 中的水相中并充分混合。
   2. 将过滤柱放入每个样品的新收集管中。
   3. 将步骤 2.3.1 中最多 700 μL 的裂解物和乙醇转移到滤筒中，并以 10,000 x g 离心 30 秒。
   4. 如果剩余 >700 μL 混合物，将滤液放入新试管中，然后重复步骤 2.3.3;重复直到整个混合物通过滤芯。
   5. 测量流出物的总体积。
   6. 将 2/3 体积的 100% 乙醇加入滤液中并充分混合。
   7. 将第二个滤芯放入新的收集管中。
   8. 将多达 700 μL 的样品体积转移到小柱中，并以 10,000 x g 离心 30 秒。丢弃流出液。
   9. 重复步骤 1.3.8，直到所有混合物都通过滤芯。
   10. 将 700 μL miRNA 洗涤液 1 涂到滤筒中，并将滤筒与收集管以 10,000 x g 离心 15 秒。丢弃流出液。将滤芯放入同一收集管中。
   11. 将 500 μL 洗涤液 2/3 加入滤筒中，并将滤筒与收集管一起以 10,000 x g 离心 15 秒。丢弃流出液。将滤芯放入新的收集管中。
   12. 将滤筒放入新的收集管中，用 500 μL 洗涤液 2/3 重复步骤 2.3.11。丢弃流通液，将滤芯转移到新的收集管中。
   13. 将带有滤筒的试管以 10,000 x g 离心 1 分钟。
   14. 将滤芯转移到新的 1.5 mL 收集管中，加入 100 μL 预热 （95 °C） 洗脱液或无核酸酶的水。
   15. 以 10,000 x g 离心 30 秒以回收 miRNA 并储存在 -80 °C.
       注意:洗涤液 2/3 中可能形成白色沉淀。该沉淀物是从溶液中释放的过量 EDTA。避免在移液步骤中吸取这些晶体。

材料