循环miRNA提取：通过有机提取和小RNA富集从血浆样本中分离miRNA的方法

摘要

来源：Canale, M. 等., 检测转移性结直肠癌患者循环 microRNA 定制 panel。J. Vis. Exp. (2019)。

本视频介绍了使用有机提取法结合玻璃纤维柱富集技术，从结直肠癌患者血浆样本中提取循环microRNA的方法。miRNA在血清和血浆等生物体液中具有良好的稳定性，使其成为癌症诊断、预后评估以及治疗决策与监测的理想循环生物标志物。该方法将有助于发现能够预测患者临床结局的新型循环生物标志物。

方案

注意： 所有以下步骤均须在符合优良实验室规范（GLP）的无菌通风橱中进行。

1. 血浆采集与保存

1. 在 K3E EDTA 管中采集 3 mL 外周血样本。
2. 在室温下以 1,880 × g 离心 15 分钟。
3. 将上清液血浆分装为每份 450 µL。
4. 将样本储存于 -80 °C，直至使用。
   注意： 采集后需在 2 小时内处理外周血样本。回收血浆时，切勿扰动淋巴细胞层。

2. 从血浆样本中提取循环miRNA

1. 准备提取步骤所需的所有溶液，并将样本解冻。
   1. 向2倍变性溶液中加入375 µL的2-巯基乙醇，并充分混匀。
   2. 向miRNA洗涤溶液I中加入21 mL分析纯级100%乙醇，并充分混匀。
   3. 向洗涤溶液2/3中加入40 mL分析纯级100%乙醇，并充分混匀。
   4. 将一份血浆等分试样在室温下解冻，然后开始提取步骤。

2. 有机提取
   1. 将400 µL血浆样本转移至一个无RNase的2 mL离心管中。
   2. 加入400 µL 2倍变性溶液，涡旋混匀后短暂离心。
   3. 加入4 µL 1 nM的外源添加物（spike-in），涡旋混匀后短暂离心。
   4. 加入800 µL酸性酚-氯仿溶液。
   5. 涡旋振荡60秒，并在最大转速（≥10,000 x g）下离心15分钟。
   6. 将上层水相转移至新的离心管中，注意勿扰动中间层。记录回收体积，并丢弃含有非水相的离心管。
      注意： 2倍变性溶液在4 °C下储存时可能析出固体。使用前需将其在37 °C水浴中预热，并间歇摇动10–15分钟。吸取酸性酚-氯仿混合液时，务必取底部的有机相，避免吸取上层的水相缓冲液。将洗脱液或无核酸酶水预热至95 °C。注意准备足够的加热液体体积（每样本100 µL + 10%余量）。

3. 小RNA富集
   1. 向步骤2.2.6所得水相中加入1/3体积的100%乙醇，并充分混匀。
   2. 为每个样品将一个过滤柱放入新的收集管中。
   3. 将最多700 µL来自步骤2.3.1的裂解液与乙醇混合液转移至过滤柱中，在10,000 x g 下离心30秒。
   4. 若剩余混合液体积超过>700 µL，则将滤过液转移至新管中并重复步骤2.3.3；重复操作直至全部混合液通过过滤柱。
   5. 测量滤过液的总体积。
   6. 向滤过液中加入2/3体积的100%乙醇，并充分混匀。
   7. 将第二个过滤柱放入新的收集管中。
   8. 将最多700 µL样品体积转移至过滤柱中，在10,000 x g 下离心30秒，弃去滤过液。
   9. 重复步骤2.3.8，直至全部混合液通过过滤柱。
   10. 向过滤柱中加入700 µL miRNA洗涤液1，在10,000 x g 下离心15秒，弃去滤过液。将过滤柱放回同一收集管中。
   11. 向过滤柱中加入500 µL洗涤液2/3，在10,000 x g 下离心15秒，弃去滤过液。将过滤柱转移至新的收集管中。
   12. 将过滤柱放入新的收集管中，用500 µL洗涤液2/3重复步骤2.3.11。弃去滤过液，并将过滤柱转移至另一新的收集管中。
   13. 将装有过滤柱的收集管在10,000 x g 下离心1分钟。
   14. 将过滤柱转移至新的1.5 mL收集管中，加入100 µL预热（95 °C）的洗脱液或无核酸酶水。
   15. 在10,000 x g 下离心30秒以回收miRNA，并于-80 °C保存。
       注意：洗涤液2/3中可能出现白色沉淀，此为溶液中释放的过量EDTA。在移液操作中应避免吸入这些晶体。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
无RNase安全锁1.5 mL离心管	Eppendorf	0030 123.328
无RNase 1000 µL吸头	Starlab	S1122-1830
无RNase安全锁2 mL离心管	Eppendorf	0030 123.344
无RNase 20 µL吸头	Starlab	S1123-1810
无RNase 200 µL吸头	Starlab	S1120-8810
mirVana PARIS RNA和天然蛋白纯化试剂盒	Thermo Fisher	AM1556
100%无水乙醇（ACS级）	Carlo Erba Reagents	414605
2-巯基乙醇	Sigma-Aldrich	M3148
0.2-2、1-10、2-20、20-200、100-1000 µL移液器
通风橱
台式微量离心机
涡旋振荡器