粪便微生物DNA提取：研究环境富集对小鼠肿瘤模型中微生物组多样性的影响

摘要

来源：Fuller, A. K, 等。 一种定义环境富集对小鼠结肠肿瘤模型中结肠微生物组多样性影响的方法。J. Vis. Exp. (2018)。

本视频介绍了从结肠肿瘤小鼠粪便样本中分离DNA的实验方案。提取的DNA通过PCR扩增，产物再采用基于磁珠的方法进行纯化。该方法可用于研究环境富集对结肠微生物群及动物死亡率的影响。

方案

所有涉及动物的实验程序均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 从粪便中分离基因组DNA

注意：按照粪便病原体检测方案，使用商业试剂盒从粪便中分离微生物DNA。将样品直接从-80 ˚C冰箱中取出，并在称重时置于干冰上保存。

1. 将最多220 mg的粪便转移至含有1.4 mL室温（RT）粪便裂解缓冲液的洁净微量离心管中（参见材料表）。
2. 涡旋震荡样品1分钟，充分均质化固体物质（图1B）。将悬液于95 ˚C加热5分钟，以裂解所有细菌（包括革兰氏阳性菌）。
3. 涡旋震荡样品15秒，然后在20,000 × g离心1分钟，使粪便固体沉淀。将上清液转移至2 mL微量离心管中。向每个样品中加入一片去除PCR抑制剂的试剂片，涡旋至完全溶解，并在室温下孵育1分钟。
4. 在20,000 × g离心3分钟，将上清液转移至新的微量离心管中，再次在20,000 × g离心3分钟。取15 μL蛋白酶K（20 mg/mL储存液）加入新的1.5 mL微量离心管中。用移液器将200 μL样品加入含蛋白酶K的管中。
5. 向管中加入200 μL盐酸胍裂解缓冲液，充分涡旋震荡15秒（参见材料表），并将样品于70 ˚C孵育10分钟。向管中加入200 μL乙醇（96–100%），通过涡旋充分混匀。
6. 将基于二氧化硅的离心柱置于2 mL收集管中，将样品加入柱中。盖紧盖子，在20,000 × g离心1分钟。
7. 将离心柱转移至新的2 mL收集管中，向柱中加入500 μL洗涤缓冲液1，盖上盖子，在20,000 × g离心1分钟。再将离心柱转移至另一新的2 mL收集管中，加入500 μL洗涤缓冲液2，盖紧盖子，在20,000 × g离心3分钟。
8. 保持盖子闭合，将离心柱转移至新的2 mL收集管中，在20,000 × g额外离心1分钟，以去除残留的洗涤缓冲液。将离心柱转移至标记好的1.5 mL微量离心管中，通过向膜上加入200 μL含EDTA的洗脱缓冲液来洗脱样品（参见材料表）。
9. 盖紧盖子，在室温下孵育1分钟。在20,000 × g离心1分钟。弃去离心柱。

2. DNA 浓度测定及 PCR 样品制备

注意：使用荧光计和市售的双链DNA荧光检测试剂盒测定每个样品中的基因组DNA浓度（参见材料表）。荧光染料必须特异性结合双链DNA。

1. 将每个样品稀释1:200（每个样品1 µL加入199 µL dsDNA主混合液中），标准品稀释1:50。使用荧光计的dsDNA检测模式进行分析。
   注意： PCR中过高的DNA量可能产生抑制作用，因此所用DNA体积不得超过PCR终体积的10%。荧光计可准确测定样品中的DNA含量，因为只有与荧光染料结合的DNA才会发出荧光，从而排除了污染物对最终计算DNA浓度的可能干扰。这种精确的定量对于后续的测序应用至关重要。
2. 用适量的10 mM Tris（pH 8.5）将PCR模板稀释至5 ng/μL，制备各样品的工作模板储备液。
3. 将样品储存在-20 °C。

3. 设计针对16S目标V区的引物

1. 设计引物以选择性扩增目标的16S rRNA V区。
2. 使用核糖体数据库项目（Ribosomal Database Project）中的Probe Match分析引物，以确定针对不同门类的大致匹配率。
   注意： 本研究针对V1-V3区采用了已发表的引物Bosshard正向引物（结合于V1区第8位点）和533反向引物（结合于V3区第533位点）。引物必须包含用于加标签的接头适配序列。
3. 设计引物时，在每个引物的5'端添加接头序列，具体如16S宏基因组测序文库制备所推荐（表1）。
4. 通过柱纯化方法合成这些较长的引物。将干燥引物重悬，并用10 mM Tris（pH 8.5）稀释成1 μM的PCR工作液。

4. 添加接头序列的扩增子PCR以扩增V区

1. 按照表2所述设置扩增子PCR反应体系。
2. 在PCR板上加盖透明粘性密封膜，并根据表3中的参数运行扩增子PCR程序。
3. （可选）将扩增子PCR产物在琼脂糖凝胶或高灵敏度DNA检测中进行电泳分析，以定量测定扩增子大小（见材料表）。
   注意：本研究中扩增子大小为550 bp（图2a）。

5. 使用磁珠进行 PCR 产物纯化

1. 将扩增PCR板在1,000 × g下短暂离心1分钟，以收集冷凝液。
   注意：可使用PCR管条代替PCR板，以尽量减少污染。弃去管盖，切勿重复使用。
2. 涡旋振荡磁珠使其均匀分散，向每个扩增PCR孔中加入20 μL磁珠，然后缓慢吹打混合10次，确保全部液体充分混匀。
3. 在室温下孵育5分钟。将PCR板置于磁力架上2分钟，直至磁珠完全聚集且上清液澄清。移除并弃去上清液。
4. 当PCR板仍置于磁力架上时，用200 μL新鲜的80%乙醇洗涤磁珠，并在室温下于磁力架上孵育30秒。小心移除上清液。
5. 重复洗涤一次。然后使用细尖移液枪头小心吸除各孔中残留的乙醇，并在空气中干燥10分钟。
6. 将PCR板从磁力架上取下，向每孔中加入52.5 μL的10 mM Tris（pH 8.5）。上下吹打10次以充分重悬磁珠，室温孵育2分钟。
7. 将PCR板转移至磁力架上使磁珠聚集，吸取50 μL上清液转移至新的洁净PCR板中。在板上贴上透明粘性PCR密封膜，于-20 ˚C保存，最多可保存一周。

扩增子 PCR 引物
正向引物	5'-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGagagtttgatcMtggctcag-3'
反向引物	5'- GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGTTACCGCGGCTGCTGGCAC -3'
位点特异性序列以粗体显示，非粗体部分为悬垂接头序列。

表1：扩增子PCR引物。

扩增子PCR反应体系配制
	体积
微生物DNA（5 ng/μl）	2.5 μl
正向引物（1 μM；来自步骤3.1）	5.0 μl
反向引物（1 μM；来自步骤3.1）	5.0 μl
2X HotStart Ready Mix	12.5 μl
总计	25.0 μl

表2：扩增子PCR引物。

扩增子 PCR 设置
95 °C 3 分钟
25 个循环：
	95 °C 30 秒
	55 °C 30 秒
	72 °C 60 秒
72 °C 3 分钟
4 °C 保存

表3：扩增子PCR程序设置。

结果

图1：环境丰富化（EE）与普通环境（NE）饲养条件及粪便匀浆（如实验方案所述）

图2：16S微生物组文库构建。 （A）由粪便基因组DNA扩增获得的未纯...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1.5 mL 微量离心管 - 无 RNA 酶和 DNA 酶	任意供应商
QIAamp DNA Stool MiniKit	Qiagen	51504	该试剂盒提供 50 次 DNA 提取所需的试剂。粪便裂解缓冲液 = ASL；盐酸胍裂解缓冲液 = AL；含盐酸胍的洗涤缓冲液 1 = AW1；洗涤缓冲液 2 = AW2；含 EDTA 的洗脱缓冲液 = AE
水浴锅（可加热至 95 摄氏度）	任意供应商		用于 94 摄氏度孵育粪便样本以裂解细胞
水浴锅（可加热至 70 摄氏度）	任意供应商		用于 70 摄氏度孵育粪便样本
乙醇（200 证明度）	Sigma Aldrich	E7023
Qubit dsDNA 宽范围检测试剂盒	ThermoFisher Scientific	Q32850
EB 缓冲液或 10 mM Tris pH 8.5	Qiagen	19086
实验特异性引物	任意供应商
PCR 级水	任意供应商
2X KAPA HiFi HotStart 预混液	Kapa Biosystems	KK2601	用于扩增子扩增（1.25 mL 可支持 100 次反应）
用于运行诊断凝胶的琼脂糖	任意供应商
蛋白酶 K（600 mAU/ml）	Qiagen	19131	相当于 20 mg/ml 的蛋白酶 K。随 QIAamp 试剂盒提供
Agencourt AMPure XP 磁珠	Beckman Coulter	A63880	用于 PCR 产物纯化的磁珠，5 mL 可纯化 250 次 PCR 反应
磁力架	Life Technologies	AM10027
荧光计：Qubit	ThermoFisher Scientific	Q33216
文库制备指南	Illumina		Illumina. 16S 宏基因组测序文库制备：为 Illumina MiSeq 系统制备 16S 核糖体 RNA 基因扩增子。https://support.illumina.com/ content/dam/illumina-support/ documents/documentation/ chemistry_documentation/16s/16s/metagenomic-library-prep guide-15044223-b.pdf。
MicroAmp 光学 96 孔反应板	Applied Biosystems/ThermoFisher
透明粘性板封膜	Applied Biosystems /ThermoFisher	4360954	Applied Biosystems/ThermoFisher Microamp 粘性封膜