粪便微生物 DNA 分离:研究环境富集对小鼠肿瘤模型中微生物组多样性的影响

Abstract

来源:Fuller， A. K， et al. 一种定义环境富集对小鼠结肠肿瘤模型中结肠微生物组生物多样性影响的方法。J. Vis. Exp. （2018 年）。

该视频描述了从荷结肠瘤小鼠粪便样本中分离 DNA 的方案。使用 PCR 扩增提取的 DNA，并使用基于磁珠的方法进一步清洁产物。该方法可用于确定环境富集对结肠微生物群和动物死亡率的影响。

Protocol

所有涉及动物的程序均已由当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会审查。

1. 从粪便中分离基因组 DNA

注意:按照粪便病原体检测方案，利用市售试剂盒从粪便中分离微生物 DNA。直接从 -80 °C 冰箱中取出样品，并在称量时储存在干冰上。

1. 将多达 220 mg 的粪便转移到含有 1.4 mL 室温 （RT） 粪便裂解缓冲液的干净微量离心管中（参见材料表）。
2. 涡旋样品 1 分钟以彻底均质固体（图 1B）。将悬浮液加热至 95 °C 5 分钟以裂解所有细菌（包括革兰氏阳性菌）。
3. 涡旋样品 15 秒，然后以 20,000 x g 离心 1 分钟以沉淀粪便固体。将上清液转移至 2 mL 微量离心管中。向每个样品中加入一片以吸收 PCR 抑制剂，涡旋直至片剂溶解，然后将样品在 RT 下孵育 1 分钟。
将
4. 样品以 20,000 x g 离心 3 分钟，然后将上清液转移到新的微量离心管中。以 20,000 x g 离心 3 分钟。将 15 μL 蛋白酶 K（20 mg/mL 储备液）分装到新的 1.5 mL 微量离心管中。将 200 μL 样品移液到含有蛋白酶 K 的试管中。
5. 向试管中加入 200 μL 氯胍裂解缓冲液，彻底涡旋 15 秒（参见材料表），并将样品在 70 °C 下孵育 10 分钟。向试管中加入 200 μL 乙醇 （96-100%），涡旋混合均匀。
6. 将硅胶离心柱放入 2 mL 收集管中，然后将样品涂在柱上。盖上盖子，以 20,000 x g 离心 1 分钟。
7. 将色谱柱转移至新的 2 mL 收集管中，向色谱柱中加入 500 μL 洗涤缓冲液 1，加盖色谱柱并以 20,000 x g 离心 1 分钟。将色谱柱转移到新的 2 mL 收集管中，向色谱柱中加入 500 μL 洗涤缓冲液 2， 盖上盖子，以 20,000 x g 离心 3 分钟。
8. 盖上盖子，将色谱柱转移到新的 2 mL 收集管中，并以 20,000 x g 的离心速度再离心 1 分钟，以去除残留的洗涤缓冲液。将色谱柱转移至 1.5 mL 标记的微量离心管中，向膜中加入 200 μL 含有 EDTA 的洗脱缓冲液洗脱样品（参见材料表）。
9. 盖上盖子并在 RT 下孵育 1 分钟，以 20,000 x g 的速度离心样品 1 分钟，丢弃色谱柱。

2. PCR 的 DNA 浓度测定和样品制备

注意:使用荧光计和市售的 dsDNA 荧光测定法测定每个样品中的基因组 DNA 浓度（参见材料表）。荧光染料必须特异性结合双链 DNA。

1. 制备每个样品的 1:200 稀释液（每个样品 1 μL 在 199 μL dsDNA 预混液中）和 1:50 稀释的标准品。在荧光计上使用 dsDNA 设置进行分析。
   注意:PCR 中的高体积 DNA 可能具有抑制作用，因此，使用的 DNA 体积不得超过 PCR 最终体积的 10%。荧光计可以准确测量样品中的 DNA，因为只有与荧光染料结合的 DNA 才会发出荧光，从而消除了污染物对最终计算的 DNA 浓度的可能影响。这种水平的准确定量对于下游测序应用至关重要。
2. 用适当体积的 10 mM Tris（pH 值为 8.5）制备稀释至 5 ng/μL 的 PCR 模板，以制备每个样品的工作模板储备液。
3. 将样品储存在 -20 °C。

3. 针对 16S 所需 V 区域设计引物

1. 设计引物以选择性扩增所需的 V 16S rRNA 区域。
2. 使用核糖体数据库项目中的 Probe Match 分析引物，以确定各种门的近似命中率><。 注意:对于 V1-V3 区域，当前研究使用已发表的引物 Bosshard forward，它在 V1 区域内的位置 8 结合，以及 533 reverse，它在 V3 区域内的位置 533 结合。引物必须包含用于索引的突出端接头序列。
3. 设计引物时，在每个引物的 5' 末端包括接头序列，如用于 16S 宏基因组测序文库制备的推荐（表 1）。
4. 通过小柱纯化合成这些大引物。重构干燥的引物，并将 PCR 工作储备液稀释至 1 μM，溶于 10 mM Tris，pH 值为 8.5。

4. 扩增 PCR 以扩增连接突出端接头序列的 V 区

1. 如表 2 所述设置扩增子 PCR 反应混合物。
2. 将透明 PCR 板密封在板上，并使用表 3 中的参数运行扩增子 PCR。
3. （可选）在琼脂糖凝胶或高灵敏度 DNA 测定上运行扩增子 PCR 产物，可定量测量扩增子大小（参见材料表><）。 注意:本研究的扩增子大小为 550 bp（图 2a）。

5. 使用磁珠进行 PCR 纯化

将
1. 扩增子 PCR 板以 1,000 x g 的速度快速离心 1 分钟以收集冷凝物><。 注意:可以使用 PCR 联排管代替 PCR 板，以最大限度地减少污染。丢弃管盖，切勿重复使用。
2. 涡旋磁珠以均匀分散它们，并向每个扩增子 PCR 孔中加入 20 μL 磁珠，然后缓慢上下移液整个体积 10 次。
3. 在 RT 下孵育 5 分钟。将 PCR 板放在磁力架上 2 分钟，直到收集到磁珠并且上清液澄清。取出并丢弃上清液。
4. 当 PCR 板位于磁力架上时，用 200 μL 新鲜的 80% 乙醇洗涤珠子，并在磁力架上的 RT 下孵育 30 秒。小心去除上清液。
5. 第二次重复洗涤。现在，使用精细的移液器吸头从孔中去除任何残留的乙醇，并风干 10 分钟。
6. 从磁力架上取下 PCR 板，向每个孔中加入 52.5 μL 的 10 mM Tris pH 8.5。上下移液 10 次以悬浮珠子并在室温下孵育 2 分钟。
7. 将 PCR 板转移到磁力架上以收集磁珠，并将 50 μL 上清液转移到干净的 PCR 板中。将粘性透明 PCR 板密封在板上，并在 -20 °C 下储存长达一周。

<表格border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"> 扩增子 PCR 引物 向前 5'-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGagagtttgatcMtggctcag-3' 反向 5'- GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGTTACCGCGGCTGCTGGCAC -3' 基因座特定序列以粗体显示，非粗体是突出端适配器序列。

表 1:扩增子 PCR 引物。

<表格border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"> 扩增子 PCR 反应体系构建 卷 微生物 DNA （5 ng/μl） 2.5 微升 正向引物（1 μM;来自步骤 3.1） 5.0 微升 反向引物（1 μM;从步骤 3.1 开始） 5.0 微升 2X 热启动预混液 12.5 微升 总 25.0 微升

表 2:扩增子 PCR 引物。

<表格border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"> 扩增子 PCR 设置 95 °C 3 分钟 25 次循环: 95 °C 30 秒 55 °C 30 秒 72 °C 持续 60 秒 72 °C 3 分钟 保持在 4 °C

表 3:扩增子 PCR 程序设置。

Results

图 1:EE 和 NE 外壳条件和粪便匀浆（如方案中所述）

图 2:16S 微生物组文库制备。（A） 来源于粪便基因组 DNA 的未纯化 PCR 扩增子产物。（B） 根据所使用的软件（材料表）设计的分度板图形。双索引组合 I7 （索引 1;行）和 I5（索引 2;Column） 显示。每个索引的长度为 8 bp。样本编号是指 EE 研究中的相应小鼠编号。（C） 未纯化的索引 PCR 产物。（D） 最终纯化和混合的 16S 文库的质量分析。（A、C、D）黑色箭头表示 550...

Materials