结直肠癌类器官细胞标记：一种生成GFP慢病毒转导的结直肠癌类器官细胞的方法

摘要

来源：Okazawa Y. 等，利用GFP慢病毒转导的患者来源结肠肿瘤类器官培养物进行微转移灶的高灵敏度检测。J. Vis. Exp. (2018)。

本视频介绍了通过GFP慢病毒颗粒转导生成结直肠癌类器官的技术，以实现荧光成像。将这些GFP标记的类器官植入动物模型后，有助于研究肿瘤的侵袭和转移过程。

方案

1. 在人工细胞外基质上培养结直肠癌类器官的生成

结肠PDX的结直肠癌类器官培养实验步骤如图1B所示（步骤4）。

1. 采用先前报道的人结肠类器官培养方法，配制适合PDX来源的结直肠癌（CRC）类器官生长的培养基（参见材料表中"结直肠癌类器官培养基"）。
2. 在冰上向12孔板的每个孔中加入150 µL人工细胞外基质（参见材料表），随后在37 °C、5% CO₂培养箱中孵育30–60分钟，使凝胶完全固化。
3. 将来自PDX小鼠模型的结直肠癌细胞沉淀用步骤1.1配制的CRC类器官培养基重悬，并添加5%胎牛血清（FCS），调整细胞密度至3 × 10⁵ 个细胞/mL。然后，将1 mL细胞悬液接种至步骤1.2中已包被人工细胞外基质的培养板中，在37 °C、5% CO₂条件下过夜培养。使用血细胞计数板对细胞悬液中的肿瘤细胞数量进行计数，计数时包括单个细胞和多细胞团簇（即黏附在一起的细胞群）。
   注意：本研究中使用5% FCS以中和胶原酶的残余酶活性。
4. 次日，小心收集含有从人工细胞外基质包被孔板上脱落的漂浮细胞的培养液，转移至1.5 mL离心管中，在1,400 × g条件下离心5分钟。弃去上清液，将细胞沉淀在冰上用70 µL人工细胞外基质重悬。
5. 为提高结直肠癌细胞的存活率，将含有肿瘤细胞的人工细胞外基质覆盖于已贴附在人工细胞外基质包被孔板上的肿瘤类器官细胞上，在37 °C、5% CO₂培养箱中孵育30分钟，使人工细胞外基质涂层固化。随后加入含1% FCS的1 mL CRC类器官细胞培养基，在37 °C、5% CO₂条件下继续培养。
6. 每两天更换一次培养基。当类器官生长密集、占据大部分培养空间时，可能需要每天更换培养基。

2. GFP 慢病毒颗粒的生成与富集

GFP慢病毒颗粒的产生与富集实验步骤见图1C（步骤5）。

1. 用含10% FCS的Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640培养基培养HEK293T细胞，并准备六个10 cm培养皿（2 x 10⁶ 每皿细胞数）用于后续转染实验。
2. 每皿转染时，在无菌的1.5 mL离心管中制备500 µL混合液，其中包含20 µL转染试剂、PRRL-GFP质粒（5 µg）、以及两种慢病毒包装质粒，如pCMV-VSV-G（1 µg）和pCMV-dR8.2 dvpr（5 µg），均溶于DMEM中。室温静置20分钟，随后将混合液均匀覆盖至各10 cm培养皿中，于37℃孵育18小时。
3. 吸去培养基，向每皿中加入 5 mL 新鲜的含 10% FCS 的 RPMI 1640 培养基，静置培养 24 h。
4. 将每皿中的条件培养基收集至50 mL离心管中，共收集30 mL，于4 °C过夜保存。向每皿中加入5 mL新鲜RPMI 1640培养基，静置24 h。
5. 将每皿中的条件培养基收集至50 mL离心管中，总共保留30 mL培养基置于冰上，随后弃去细胞。
6. 将步骤2.4–2.5中获得的培养基60 mL通过0.45 µm滤膜过滤，以去除细胞，并将滤液分装至十二个5 mL聚丙烯离心管中，用于超速离心。
7. 为浓缩病毒，使用摆动桶转子在85,327 x g条件下离心 g 4 °C下孵育1.5小时
8. 立即移除培养基。为溶解浓缩的病毒沉淀，向十二个试管中每管加入250 µL不含FCS的F-12/DMEM培养基（Nutrient Ham's Mixture F-12 (F12)/DMEM），并在4 °C下静置过夜。注意病毒沉淀通常不可见。
9. 轻轻吹打培养基，收集总共约 3 mL 浓缩的 5x GFP 慢病毒原液，其中 presumably 包含带有 10 的 GFP 慢病毒颗粒⁸ 每毫升转导单位（TU/mL）。然后将十二个1.5 mL微量离心管（每管含250 µL）在无菌条件下于-80 °C保存，可保存长达一年。制备大量原始溶液的小份分装，以避免反复冻融-冻融循环。

3. 在人工细胞外基质上培养的结直肠癌类器官细胞的GFP慢病毒颗粒标记

用GFP慢病毒标记CRC类器官细胞的实验步骤如图1C所示（步骤6）。

1. 将步骤 1.6 中制备的结直肠癌（CRC）类器官在无干扰条件下培养 7-10 天，使用无菌细胞刮刀机械收获，并转移至 1.5 mL 微量离心管中。
   注意： 结直肠癌类器官在体外培养中的生长情况取决于患者原始肿瘤的性质。在传代时，应将类器官维持在 60–70% 汇合度，并以 1:2 的比例接种至新的包被有人工细胞外基质的 12 孔板中，以避免类器官过度生长。
2. 将微量离心管在 1,400 × g 条件下离心 3 分钟，弃去培养基，并通过轻弹管壁将细胞沉淀重悬于 500 µL 磷酸盐缓冲液（PBS）中。
3. 将微量离心管在 1,400 × g 条件下离心 3 分钟，弃去 PBS。
4. 为解离贴壁的结直肠癌类器官，向管中的细胞沉淀加入 500 µL 含蛋白酶和胶原酶的细胞解离溶液，通过轻弹混匀，然后将管子在室温下静置 10 分钟。
5. 在 1.5 mL 微量离心管中，用额外的 500 µL 含 1% 胎牛血清（FCS）的 DMEM 培养基，用移液器轻轻吹打数次，使细胞大致解离。剧烈吹打以获得单细胞会显著降低细胞活力。因此，必须通过轻柔吹打，使细胞悬液中仍可见细胞团块。
6. 将细胞悬液在 1,400 × g 条件下离心 3 分钟，弃去上清液。
7. 在 1.5 mL 微量离心管中，通过轻弹将细胞沉淀重悬于 100 µL 5 倍浓缩的 GFP 慢病毒原液（>10⁸ TU/mL）与 400 µL 结直肠癌类器官培养基的混合液中，调整浓度至每 500 µL 含 5 × 10⁵ 个解离的肿瘤细胞。使用血细胞计数板对细胞悬液中的肿瘤细胞数量进行计数，包括单个细胞和细胞团，方法如前所述（步骤 1.3）。
8. 按照步骤 1.2 所述方法准备包被有人工细胞外基质的 12 孔板。然后，将步骤 3.7 中制备的 500 µL 细胞悬液加入孔中，于 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育 18 小时。
9. 收集从包被有人工细胞外基质的孔板上脱落并悬浮的细胞培养液，转移至 1.5 mL 离心管中。在 1,400 × g 条件下离心后，弃去上清液，并将沉淀在冰上重悬于 70 µL 人工细胞外基质中。
10. 为提高结直肠癌细胞的存活率，将含有肿瘤细胞的人工细胞外基质覆盖于已贴壁在包被有人工细胞外基质的 12 孔板上的肿瘤类器官上，操作如步骤 1.5 所述。随后，将培养板置于 37 °C、5% CO₂ 培养箱中孵育 30 分钟，使人工细胞外基质凝固，然后加入 1 mL 含 1% FCS 的结直肠癌类器官培养基，在 37 °C、5% CO₂ 条件下继续培养。
11. 感染后三天在荧光显微镜下观察细胞，确认由于使用了高滴度的慢病毒颗粒，GFP 阳性率接近 100%（见 图 2A）。
12. 将结直肠癌类器官继续培养 7–10 天，以扩增细胞数量，为后续注射至受体小鼠做准备。

结果

图1：在NOG小鼠中，由GFP慢病毒标记的PDX来源的CRC类器官生成转移灶的示意图。 (A) 将小块CRC组织皮下植入NOG小鼠（步骤1）。从患者体内手术分离的CRC组织被切成小块，并皮下植入NOG小鼠体内。s.c.：皮下植入。(B) 从PDX中分离获得CRC类器官（步骤2–4）。将生长的CRC异种移植瘤组织切碎（步骤2），转移至含有包括胶原酶的培养基的15 mL离心管中（步骤3）。经缓慢振荡孵育后，对CRC细胞悬液进行过滤（步骤3）。然后，将CRC类器官细胞悬液接种到包被有人工细胞外基质的培养板上，并在CO₂培养箱中过夜孵...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
12孔板	BMBio	#92412
微量离心管  	Eppendorf	#0030120086	使用前高压灭菌
血细胞计数板 	Erma	#03-202-1
Matrigel基底膜基质   	Corning	#354234	分装后于-20°C保存。使用前置于冰上
Ⅰ型胶原酶  	Sigma	#C1030	将Ⅰ型胶原酶配制成150 mg/ml的1×PBS溶液。分装后于-20°C保存，最长可保存1年
含GlutaMAX的DMEM/F-12培养基™ 	Gibco	#10565018
青霉素  	Gibco	#15140122	4°C保存。1个月内使用完毕
hEGF 	PEPROTECH 	#AF-100-15 	-20°C保存。当天使用当天加入培养基
Y27632（ROCK抑制剂）  	Wako 	#253-00591	-20°C保存。当天使用当天加入培养基
链霉素  	Gibco	#15140122	4°C保存。1个月内使用完毕
含1%或5% FCS的CRC类器官培养基			在含GlutaMAX的DMEM/F-12培养基™（Gibco #10565018）中添加1%或5% FCS、100 U/ml青霉素、100 µg/ml链霉素、2 ng/ml hEGF和10 µM Y27632（ROCK抑制剂）配制而成。4°C保存，1个月内使用完毕。
PRRL-GFP载体 	由Robert A. Weinberg博士惠赠
FuGENE 6转染试剂 	Roche 	11814 443001
pCMV-VSV-G	由Robert A. Weinberg博士惠赠
pCMV-dR8.2 dvpr 	由Robert A. Weinberg博士惠赠
Zeiss Axioplan 2体视荧光显微镜 	Zeiss