建立实验性转移小鼠模型：在PDX模型中植入表达GFP的结直肠癌类器官细胞以检测微转移灶

摘要

来源：Okazawa, Y. 等等。  利用GFP慢病毒转导的患者来源结肠肿瘤类器官培养物中产生的微转移灶的高灵敏度检测 J. Vis. Exp. (2018).

本视频介绍了将经GFP慢病毒标记的PDX来源的结直肠癌类器官移植至免疫缺陷小鼠脾脏以生成转移瘤的实验方案。通过荧光显微镜检测GFP表达，可观察到定植于其他器官的癌症微转移灶。

方案

所有涉及动物的实验程序均已经过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会审核。

1. 通过GFP标记的结直肠癌类器官在受体小鼠中生成转移灶

1. 建立结直肠癌PDX的实验性转移模型：
   1. 制备结直肠癌类器官细胞悬液，每只小鼠使用50 µL PBS中含4 x 10⁴个细胞的悬液。使用前将细胞悬液置于冰上保存。使用血细胞计数板对癌细胞进行计数。（计数细胞悬液中包括单细胞和多细胞团簇在内的肿瘤细胞数量）。
   2. 使用小动物吸入式麻醉装置通过异氟烷吸入麻醉小鼠，并用70%乙醇对皮肤进行消毒。确认呼吸频率和深度正常，且无足趾夹捏反射，以确保麻醉效果充分。可选择性地在眼部涂抹兽用眼膏，以防止麻醉期间角膜干燥。
   3. 将麻醉后的NOG小鼠俯卧置于实验台面上。在左侧腹下部做一小切口，然后用无菌剪刀和镊子切开腹膜，小心暴露脾脏。用无菌镊子夹住附着在脾脏上的脂肪组织，缓慢将50 µL细胞悬液（按上述步骤1.1制备）注射入脾脏。务必确保细胞悬液正确注入脾脏，无外漏。通常每组使用4只小鼠以评估实验结果。
2. 术后将所有小鼠置于加热垫上，并保持胸卧位直至意识充分恢复。待小鼠完全清醒并能以四肢支撑坐起后，将其放回原有饲养笼中。为防止攻击行为，不得将手术小鼠与未手术动物同笼饲养。
3. 术后次日检查手术组小鼠缝合处是否渗漏，并确认其存活状态。此后每周一次检查所有小鼠是否出现疾病症状，并使用游标卡尺测量肿瘤大小。
4. 观察小鼠在注射后长达2.5个月内的自发性转移情况以及1个月内的实验性转移情况。
5. 在预定时间点，通过麻醉联合颈椎脱位法处死小鼠。解剖原发肿瘤及包括肝脏和肺在内的多种组织。将解剖所得肿瘤和器官置于盛有5 mL冰浴PBS的10 cm培养皿中，并在冰上保存。
6. 为检测GFP阳性结直肠癌类器官细胞，使用体视荧光显微镜观察解剖组织。通过CCD相机采集图像，并使用标准图像处理软件进行分析。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
NOD/Shi-scid IL2Rγ null (NOG) 小鼠	日本神奈川中央实验动物研究所	在无菌和特定病原体-free条件下饲养6周龄雄性小鼠
伤口夹 2×10 mm	日本Natsume制造公司	#C-21-S	使用前高压灭菌
Hamilton注射器针头规格：22号	东京科学公司，日本	用70%酒精和无菌PBS消毒
50 ml 锥形管	住友贝克莱特	MS-57500
微量离心管	Eppendorf	#0030120086	使用前高压灭菌
血细胞计数板	Erma	#03-202-1
CRC类器官培养基含1%或5% FCS			DMEM/F-12培养基含GlutaMAX™补充剂（Gibco #10565018），添加1%或5% FCS、100 U/ml青霉素、100 µg/ml链霉素、2 ng/ml hEGF以及10 µM Y27632（ROCK抑制剂）。4°C保存，一个月内使用完毕
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