节段性腺病毒-Cre感染：利用基因工程小鼠模型生成孤立性结直肠癌的技术

摘要

来源：Betzler, A. M.，等。 散发性结直肠癌的基因工程小鼠模型。J. Vis. Exp. (2017)。

本视频介绍了通过节段性腺病毒-cre感染建立结直肠癌小鼠模型的方法。被感染的结肠节段可导致黏膜局部发生肿瘤形成，最终发展为浸润性和转移性癌。该模型是研究癌症生物学及开展临床前治疗试验的理想平台。

方案

所有涉及动物模型的操作均已经过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 局部肿瘤诱导 通过 外科腺-cre感染

1. 手术动物准备
   注意： 几乎任何条件性（"floxed"）突变均可通过本方法诱导。建议使用与结直肠癌相关的基因突变，例如 Apc、Kras 或 Tp53。Cre 重组效率取决于待切除片段的大小，较大的 floxed 序列切除效率较低。应通过 PCR 在肿瘤中确认所有等位基因的重组情况。
   1. 为建立结直肠肿瘤，建议采用以下条件性等位基因杂交，以构建基础的结直肠癌模型（括号内为 MGI 数据库编号）：
      Apc^tm2Rak （MGI: 3688435）
      Kras^tm4Tyj （MGI: 2429948）
      Tp53^tm2Tyj （MGI: 3039263）
   2. 若需使用荧光报告等位基因（例如，用于检测微转移灶），请使用以下等位基因：
      Gt(ROSA)26Sor^{tm6(CAG-ZsGreen1)Hze} （MGI: 3809522）
      注意： 上述所有品系均可通过美国国家癌症研究所小鼠资源库（NCI Mouse Repository）或杰克逊实验室（Jackson Laboratory）获得。无需术前禁食，因所有残留粪便可在腺病毒感染前冲洗干净。术前禁食会增加围手术期死亡率，并对小型啮齿动物造成极大应激。
   3. 使用 3–3.5 vol% 的七氟烷进行全身麻醉。趾夹反射消失表明麻醉已充分。
   4. 在首次切口前，皮下注射 0.05 mg/kg 的丁丙诺啡。
   5. 用眼用软膏覆盖麻醉小鼠的眼睛，以防止角膜干燥。
   6. 将小鼠仰卧位固定于小手术台上，使用无创性胶带固定小鼠。
   7. 使用电动剃刀剃除腹部毛发（也可使用脱毛膏），并用酒精棉片或碘伏消毒，遵循生产商推荐的接触时间。
   8. 用无菌手术巾覆盖手术区域。
      注意： 围手术期是否使用抗生素取决于各机构的指南，为可选操作。
   9. 所有外科操作均应使用无菌一次性或已灭菌的器械。
2. 正中腹切开及结肠暴露
   1. 使用剪刀（也可使用手术刀）在下腹部皮肤做正中切口（约 15 mm）。
   2. 用镊子提起腹壁肌肉组织，并用剪刀小心切开，以打开腹腔。
   3. 辨认远端结肠，仅使用无创镊子接触。在距离肛门约 15 mm 处，使用精细夹钳（例如，Micro Serrefine 血管夹）夹闭结肠。
      注意： 操作过程中应始终特别注意结肠的脆弱性。一旦穿孔，将不可避免地导致腹膜炎和败血症，需对动物实施安乐死。
3. 结肠节段性腺病毒-Cre 感染
   1. 经肛门插入一根柔韧的特氟龙导管，并小心推进，直至到达此前在距肛缘 15 mm 处夹闭所形成的肠腔阻塞位置。切勿施加过大压力，以免导致穿孔。
   2. 将导管连接至 30G 套管，再连接标准 1 mL 注射器，用生理盐水冲洗结肠，以清除残留粪便。此过程可能需要数毫升生理盐水。
   3. 当远端结肠排空后，取出导管，更换为新的特氟龙导管，并如上所述重新将其置于夹钳远端紧邻处。
   4. 在近端夹钳远侧约 3 mm 处（即，在插入的导管上方，距肛缘约 12 mm）使用第二个夹钳夹闭结肠，形成一个约 3 mm 的隔离节段用于感染。
      注意： Fogarty 冠状动脉夹已被证明最适合用于该节段的远端闭合，因其具有橡胶涂层，即使在夹臂之间存在管腔内导管，也能实现紧密闭合。
   5. 使用第二个注射器（标准 1 mL 注射器配 30G 套管），小心向夹闭的结肠节段注入 50–80 µL 的 0.25% 胰蛋白酶-EDTA 溶液，孵育 10 分钟。保持套管和注射器连接在特氟龙导管上，以防止液体回流。
      注意： 结肠需适度膨胀以破坏黏膜屏障并使隐窝干细胞暴露，但不可过度膨胀，以免夹闭节段穿孔。
   6. 首先移除远端夹钳，然后取出胰蛋白酶导管。
   7. 用约 500 µL 生理盐水冲洗远端结肠，以清除残留的胰蛋白酶。
   8. 插入一根新的特氟龙导管，重新放置远端夹钳，向结肠节段注入 50–80 µL 腺病毒溶液（磷酸盐缓冲液中含 10¹¹ 蚀斑形成单位（PFU）/mL），孵育 30 分钟（图 2A）。
      注意： 切勿溢出病毒溶液，因腺病毒-Cre 接触可能在条件性突变小鼠的任何组织中引发肿瘤形成。
   9. 移除夹钳和导管。
4. 腹腔关闭与术后恢复
   1. 使用 6-0 快速可吸收缝线（例如，聚对二氧环己酮（PDS））连续缝合腹壁。
   2. 使用外科伤口夹闭合皮肤。
   3. 将小鼠置于设定为 38 °C 的加热垫上，直至完全从麻醉中恢复。
   4. 术后 12 小时腹腔注射 0.05 mg/kg 丁丙诺啡作为追加剂量，此后根据需要每 12 小时追加一次丁丙诺啡。
   5. 每天至少监测一次小鼠，观察因肿瘤生长导致的痛苦迹象。

2. 结肠镜检查

注意：根据所使用的条件性突变，腺病毒感染可在2至4周内导致内镜下可见的肿瘤。因此，建议在腺病毒诱导后2周进行首次术后结肠镜检查，并每2周重复一次。推荐使用 commercially available system 进行小鼠结肠镜检查。

1. 结肠镜检查前的动物准备
   注意：无需禁食。远端结肠中残留的粪便通常成形良好，在结肠镜检查过程中可将其推至肿瘤远端，因此无需反复禁食这一应激过程。
   1. 使用3 - 3.5 vol%的七氟烷进行全身麻醉。趾夹反射消失表明麻醉深度足够。
   2. 用眼膏覆盖麻醉小鼠的眼睛，以防止角膜干燥。
   3. 将小鼠仰卧位固定于小台面上。
2. 结肠镜检查
   1. 将内镜（直径1.9 mm，长度10 cm）经肛门插入肠道，在直视下小心充气以扩张结肠。充气量不应超过检查所需。
      注意：充气可使用结肠镜系统配备的防雾空气泵。若无防雾空气泵，也可使用其他极低压力设置的空气泵，或配备精密减压阀的加压空气。二氧化碳（CO₂）易导致小型啮齿类动物发生酸中毒，因此必须避免使用。
   2. 小心推进内镜，直至在远端结肠发现黏膜病变（图1A - 1D）。
   3. 保存内镜图像以供后续评估。已有文献描述过用于管腔内肿瘤的内镜评分系统。
   4. 小心撤出内镜，将小鼠置于设定为38 °C的加热垫上，直至其完全从麻醉中恢复。

结果

图1. 结直肠肿瘤的结肠镜图像（括号中为动物的条件等位基因）。
A. 正常远端结肠。 B. 腺病毒感染2周后的早期腺瘤。注意小鼠因携带GFP报告等位基因而呈现绿色。（Apc^tm2Rak, Kras^tm4Tyj, Gt(ROSA)26Sor^{tm6(CAG-ZsGreen1)Hze}）。 C. 晚期腺瘤（Apc^tm2Rak, Kras^tm4Tyj）。 D. 结直肠腺癌（结肠镜图像获取后经病理学确诊...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
杜尔贝科磷酸盐缓冲液	 Life Technologies GmbH 	14190169
胰蛋白酶-EDTA（0.25%，酚红）	 Life Technologies GmbH 	25200072
0.9% 生理盐水 (E154) 	Serumwerk Bernburg AG 	10013
注射用水 	B. Braun Melsungen AG 	235144
Ad5CMV-Cre（腺病毒，c = 2E+11 PFU/mL） 	基因转导载体中心，爱荷华大学
15 mL、50 mL 离心管  	Greiner Bio-One GmbH	188271/227270
Eppendorf管 1.5 mL / 2 mL 	Sarstedt AG & Co. 	72,695,400
培养皿 PS 100/15 mm（无菌，Nuclon） 	Fisher Scientific GmbH	 10508921/ NUNC150350
1 mL 注射器（无死体积） - Injekt-F SOLO 	Braun/neoLab 	194291661
30G 注射针 	BECTON DICKINSON	304000
七氟烷（Sevoflurane AbbVie） 	AbbVie Germany GmbH & Co. KG
医用氧气 	液化空气医疗有限公司
布托啡诺（Temgesic）	Indivior Eu Ltd.
Bepanthen - 眼科软膏 	Bayer Vital GmbH 	10047757
带氧气冲洗功能和七氟烷蒸发器的台式科研麻醉机	帕克兰科学 	V3000PS/PK
棉拭子 	Lohmann & Rauscher 德国 	13356
胰岛素注射器 EMG 1 mL（带30G针头）	B. Braun Melsungen AG	9161627S
细孔管（内径：0.28 mm，外径：0.61 mm）	史密斯医疗德国 8	800/100/100
微型阿德森镊	Fine Science Tools	11018-12
虹膜剪 - ToughCut	Fine Science Tools	14058-11
Olsen-Hegar持针器	Fine Science Tools	12002-12
AutoClip试剂盒	Fine Science Tools	12020-00
PDS Z1012H 6/0 C1（外科缝线）	Johnson & Johnson Medical GmbH	Z1012H
弯曲显微Serrefine血管夹	Fine Science Tools	18055-05
福加蒂弹簧夹	埃德华兹	CDSAFE 6
加热板 062	Labotect 	13854
伊西斯 - 毛发剃除器	Aesculap - Braun
Cold Light Fountain XENON 175	卡尔·史托斯	20132101-1	卡尔·史托斯 Coloview 系统，美因茨
光纤导光缆	卡尔·史托斯	69495NL	卡尔·史托斯 Coloview 系统，美因茨
TRICAM 三芯片摄像机头	卡尔·史托斯（Karl Storz）	20221030	卡尔·史托斯 Coloview 系统，美因茨
TRICAM SLII 相机控制单元	卡尔·史托斯	20223011-1	卡尔·史托斯 Coloview 系统，美因茨
15" 平板显示器 EndoVue	卡尔·史托斯（Karl Storz）	9415NN	卡尔·史托斯 Coloview 系统，美因茨
HOPKINS 直视式望远镜，直径 1.9 mm；长度 10 cm，可高压灭菌，内置光纤导光	Karl Storz	64301AA
保护与检查鞘管	Karl Storz	61029C